Mechanism of superoxide production by cytochrome bc1bc_{1} studied by modifications of individual steps of electron transpory chain

Cytochrom $\mathit{bc}_{1}$ jest białkiem łańcucha transportu elektronów. Jego działanie związane jest z budowaniem siły protonomotorycznej służącej do produkcji ATP. Oprócz reakcji katalitycznych (które konserwują energię), w pewnych warunkach mogą zachodzić reakcje uboczne, które prowadzą do dyssypacji energii. W reakcjach katalitycznych energia reakcji utleniania chinolu jest wykorzystywana do translokacji protonów w obrębie cytochromu $\mathit{bc}_{1}$. W tym przypadku, w miejscu katalitycznym Qo następuje rozdział dwóch elektronów dostarczanych przez chinol, które przepływają przez dwa odrębne łańcuchy kofaktorów. W reakcjach ubocznych, w konsekwencji może nastąpić utrata części energii z utleniania chinolu. Może być ona „rozproszona” na skutek częściowej lub całkowitej utraty funkcji translokacji protonów przez cytochrom $\mathit{bc}_{1}$. Są to reakcje, w których w miejscu katalitycznym Qo nie następuje wydajny rozdział elektronów na dwa łańcuchy kofaktorów. Jedną z reakcji ubocznych jest przekaz elektronu z semichinonu w miejscu Qo na tlen z wytworzeniem anionorodnika ponadtlenkowego. W wyniku tej reakcji oprócz spadku wydajności translokacji protonów, powstaje reaktywny rodnik, który może prowadzić do dużych uszkodzeń w komórce poprzez utlenianie różnych cząsteczek, takich jak lipidy i białka. Inną reakcją uboczną może być przekaz obydwu elektronów na jeden łańcuch kofaktorów (na łańcuch o wyższym potencjale redoks), co powoduje spadek wydajności fosforylacji oksydacyjnej. W pracy doktorskiej badane były zarówno reakcje katalityczne jak i reakcje uboczne. Praca doświadczalna nad poznaniem tych reakcji została wzbogacona pełnym teoretycznym modelem działania monomeru cytochromu $\mathit{bc}_{1}$. Model ten umożliwia poznanie działania cytochromu $\mathit{bc}_{1}$ oraz przewidzenie zachowania się badanego układu w różnych warunkach stężenia substratów i produktów, jak i efektu kinetycznego łączenia mutacji w obrębie tego białka. W pracy doktorskiej został też opisany efekt inhibicji cytochromu $\mathit{bc}_{1}$ przez jeden z substratów – chinol. Inhibicja ta jest połączona ze znacznym spadkiem aktywności białka po czasie rzędu kilkunastu – kilkudziesięciu sekund i z produkcją anionorodnika ponadtlenkowego. Efekty kinetyczne mutacji punktowych i produkcja wolnych rodników są czynnikami, które leżą u podstaw chorób mitochondrialnych. Niektóre mutacje pojawiające się w obrębie ludzkiego cytochromu b zostały przebadane w tej pracy doktorskiej. W oparciu o zdobytą wiedzę zaproponowano sposób w jaki mutacje te wpływają na funkcjonowanie białka

Liber beneficiorum Jana Łaskiego – przyczynek do krytyki źródłoznawczej gnieźnieńskiej księgi uposażeń

Badania źródłoznawcze nad księgami uposażeń beneficjów (libri beneficiorum) polskich diecezji z przełomu średniowiecza i czasów nowożytnych są właściwie nieobecne w polskiej historiografii. Jedynym wyjątkiem jest księga uposażeń autorstwa Jana Długosza. Sytuacja ta jest istotnym brakiem, wziąwszy pod uwagę znaczenie tych źródeł dla badania całego szeregu problemów historycznych. Niniejszy tekst stanowi próbę zmiany tego stanu. Przedmiotem artykułu jest analiza zagadnienia powstania, przechowywania i funkcjonowania tekstu opisu archidiakonatu kaliskiego z libri beneficiorum diecezji gnieźnieńskiej, spisanego z polecenia arcybiskupa Jana Łaskiego w ciągu drugiej i na początku trzeciej dekady XVI wieku. Tekst ma charakter przyczynkowy i stanowi próbę poruszenia pewnych podstawowych zagadnień. Studium wspomnianych problemów przeprowadzono na bazie powszechnie znanego tekstu opisu archidiakonatu kaliskiego, a także informacji z innych źródeł: zapisek konsystorskich, kapitulnych i porównania z innymi tomami księgi uposażeń Jana Łaskiego, w tym brudnopisem łęczycko-łowickim. Jednym ze źródeł i istotnym elementem studium jest wykorzystanie odpisów tekstu opisu parafii św. Michała w Dobrcu (obecnie część Kalisza), pochodzących z nieznanego dotychczas egzemplarza kaliskiej części gnieźnieńskiej księgi uposażeń. Z tego względu poświęcono im więcej miejsca i w aneksie opublikowano ich edycję. W artykule postawiono wstępne hipotezy co do organizacji prac przy zbieraniu informacji do księgi uposażeń Łaskiego, metod opracowania tekstu oraz funkcjonowania księgi w ciągu pierwszych 100 lat od jej sporządzenia

On the inter-monomer electron transfer in cytochrome bc1bc_{1}

Cytochrome $bc_{1}$ is a structural and functional homodimer. The catalytically-relevant inter-monomer electron transfer has been implicated by a number of experiments, including those based on analyses of the cross-dimer mutated derivatives. As some of the original data on these derivatives have recently been questioned, we extend kinetic analysis of these mutants to confirm the enzymatic origin of the observed activities and their relevance in exploration of conditions that expose electron transfer between the monomers. While obtained data consistently implicate rapid inter-monomer electron equilibration in cytochrome $bc_{1}$, the mechanistic and physiological meaning of this equilibration is yet to be established

Fusing two cytochromes b of Rhodobacter capsulatus cytochrome bc1 using various linkers defines a set of protein templates for asymmetric mutagenesis

Cytochrome bc1 (mitochondrial complex III), one of the key enzymes of biological energy conversion, is a functional homodimer in which each monomer contains three catalytic subunits: cytochrome c1, the iron–sulfur subunit and cytochrome b. The latter is composed of eight transmembrane α-helices which, in duplicate, form a hydrophobic core of a dimer. We show that two cytochromes b can be fused into one 16-helical subunit using a number of different peptide linkers that vary in length but all connect the C-terminus of one cytochrome with the N-terminus of the other. The fusion proteins replace two cytochromes b in the dimer defining a set of available protein templates for introducing mutations that allow breaking symmetry of a dimer. A more detailed comparison of the form with the shortest, 3 amino acid, linker to the form with 12 amino acid linker established that both forms display similar level of structural plasticity to accommodate several, but not all, asymmetric patterns of mutations that knock out individual segments of cofactor chains. While the system based on a fused gene does not allow for the assessments of the functionality of electron-transfer paths in vivo, the family of proteins with fused cytochrome b offers attractive model for detailed investigations of molecular mechanism of catalysis at in vitro/reconstitution level

Mitochondrial disease-related mutations at the cytochrome b-iron-sulfur protein (ISP) interface : molecular effects on the large-scale motion of ISP and superoxide generation studied in Rhodobacter capsulatus cytochrome bc_{1}

AbstractOne of the important elements of operation of cytochrome bc1 (mitochondrial respiratory complex III) is a large scale movement of the head domain of iron–sulfur protein (ISP-HD), which connects the quinol oxidation site (Qo) located within the cytochrome b, with the outermost heme c1 of cytochrome c1. Several mitochondrial disease-related mutations in cytochrome b are located at the cytochrome b-ISP-HD interface, thus their molecular effects can be associated with altered motion of ISP-HD. Using purple bacterial model, we recently showed that one of such mutations — G167P shifts the equilibrium position of ISP-HD towards positions remote from the Qo site as compared to the native enzyme [Borek et al., J. Biol. Chem. 290 (2015) 23781-23792]. This resulted in the enhanced propensity of the mutant to generate reactive oxygen species (ROS) which was explained on the basis of the model evoking “semireverse” electron transfer from heme bL to quinone. Here we examine another mutation from that group — G332D (G290D in human), finding that it also shifts the equilibrium position of ISP-HD in the same direction, however displays less of the enhancement in ROS production. We provide spectroscopic indication that G332D might affect the electrostatics of interaction between cytochrome b and ISP-HD. This effect, in light of the measured enzymatic activities and electron transfer rates, appears to be less severe than structural distortion caused by proline in G167P mutant. Comparative analysis of the effects of G332D and G167P confirms a general prediction that mutations located at the cytochrome b-ISP-HD interface influence the motion of ISP-HD and indicates that “pushing” ISP-HD away from the Qo site is the most likely outcome of this influence. It can also be predicted that an increase in ROS production associated with the “pushing” effect is quite sensitive to overall severity of this change with more active mutants being generally more protected against elevated ROS.This article is part of a Special Issue entitled ‘EBEC 2016: 19th European Bioenergetics Conference, Riva del Garda, Italy, July 2–6, 2016’, edited by Prof. Paolo Bernardi

Catalytically-relevant electron transfer between two hemes b_{L} in the hybrid cytochrome bc_{1}-like complex containing a fusion of Rhodobacter sphaeroides and capsulatus cytochromes b

AbstractTo address mechanistic questions about the functioning of dimeric cytochrome bc1 new genetic approaches have recently been developed. They were specifically designed to enable construction of asymmetrically-mutated variants suitable for functional studies. One approach exploited a fusion of two cytochromes b that replaced the separate subunits in the dimer. The fusion protein, built from two copies of the same cytochrome b of purple bacterium Rhodobacter capsulatus, served as a template to create a series of asymmetrically-mutated cytochrome bc1-like complexes (B–B) which, through kinetic studies, disclosed several important principles of dimer engineering. Here, we report on construction of another fusion protein complex that adds a new tool to investigate dimeric function of the enzyme through the asymmetrically mutated forms of the protein. This complex (BS–B) contains a hybrid protein that combines two different cytochromes b: one coming from R. capsulatus and the other — from a closely related species, R. sphaeroides. With this new fusion we addressed a still controversial issue of electron transfer between the two hemes bL in the core of dimer. Kinetic data obtained with a series of BS–B variants provided new evidence confirming the previously reported observations that electron transfer between those two hemes occurs on a millisecond timescale, thus is a catalytically-relevant event. Both types of the fusion complexes (B–B and BS–B) consistently implicate that the heme-bL–bL bridge forms an electronic connection available for inter-monomer electron transfer in cytochrome bc1

Mitochondrial disease-related mutation G167P in cytochrome b of Rhodobacter capsulatus cytochrome bc_{1} (S151P in human) affects the equilibrium distribution of 2Fe-2S cluster and generation of superoxide

Cytochrome bc(1) is one of the key enzymes of many bioenergetic systems. Its operation involves a large scale movement of a head domain of iron-sulfur protein (ISP-HD), which functionally connects the catalytic quinol oxidation Q(o) site in cytochrome b with cytochrome c(1). The Q(o) site under certain conditions can generate reactive oxygen species in the reaction scheme depending on the actual position of ISP-HD in respect to the Q(o) site. Here, using a bacterial system, we show that mutation G167P in cytochrome b shifts the equilibrium distribution of ISP-HD toward positions remote from the Q(o) site. This renders cytochrome bc(1) non-functional in vivo. This effect is remediated by addition of alanine insertions (1Ala and 2Ala) in the neck region of the ISP subunit. These insertions, which on their own shift the equilibrium distribution of ISP-HD in the opposite direction (i.e. toward the Q(o) site), also act in this manner in the presence of G167P. Changes in the equilibrium distribution of ISP-HD in G167P lead to an increased propensity of cytochrome bc(1) to generate superoxide, which becomes evident when the concentration of quinone increases. This result corroborates the recently proposed model in which “semireverse” electron transfer back to the Q(o) site, occurring when ISP-HD is remote from the site, favors reactive oxygen species production. G167P suggests possible molecular effects of S151P (corresponding in sequence to G167P) identified as a mitochondrial disease-related mutation in human cytochrome b. These effects may be valid for other human mutations that change the equilibrium distribution of ISP-HD in a manner similar to G167P