UA62784 Is a Cytotoxic Inhibitor of Microtubules, not CENP-E

SummaryA recent screen for compounds that selectively targeted pancreatic cancer cells isolated UA62784. We found that UA62784 inhibits microtubule polymerization in vitro. UA62784 interacts with tubulin dimers ten times more potently than colchicine, vinblastine, or nocodazole. Competition experiments revealed that UA62784 interacts with tubulin at or near the colchicine-binding site. Nanomolar doses of UA62784 promote the accumulation of mammalian cells in mitosis, due to aberrant mitotic spindles, as shown by immunofluorescence and live cell imaging. Treatment of cancerous cell lines with UA62784 is lethal, following activation of apoptosis signaling. By monitoring mitotic spindle perturbations and apoptosis, we found that the effects of UA62784 and of some known microtubule-depolymerizing drugs are additive. Finally, high content screening of H2B-GFP HeLa cells revealed that low doses of UA62784 and vinblastine potentiate each other to inhibit proliferation

Natural Loss of Mps1 Kinase in Nematodes Uncovers a Role for Polo-like Kinase 1 in Spindle Checkpoint Initiation

SummaryThe spindle checkpoint safeguards against chromosome loss during cell division by preventing anaphase onset until all chromosomes are attached to spindle microtubules. Checkpoint signal is generated at kinetochores, the primary attachment site on chromosomes for spindle microtubules. Mps1 kinase initiates checkpoint signaling by phosphorylating the kinetochore-localized scaffold protein Knl1 to create phospho-docking sites for Bub1/Bub3. Mps1 is widely conserved but is surprisingly absent in many nematode species. Here, we show that PLK-1, which targets a substrate motif similar to that of Mps1, functionally substitutes for Mps1 in C. elegans by phosphorylating KNL-1 to direct BUB-1/BUB-3 kinetochore recruitment. This finding led us to re-examine checkpoint initiation in human cells, where we found that Plk1 co-inhibition significantly reduced Knl1 phosphorylation and Bub1 kinetochore recruitment relative to Mps1 inhibition alone. Thus, the finding that PLK-1 functionally substitutes for Mps1 in checkpoint initiation in C. elegans uncovered a role for Plk1 in species that have Mps1

CENP-E forms a link between attachment of spindle microtubules to kinetochores and the mitotic checkpoint. Nat Cell Biol

Here we show that suppression of synthesis of the microtubule motor CENP-E (centromere-associated protein E), a component of the kinetochore corona fibres of mammalian centromeres, yields chromosomes that are chronically mono-orientated, with spindles that are flattened along the plane of the substrate. Despite apparently normal microtubule numbers and the continued presence at kinetochores of other microtubule motors, spindle poles fragment in the absence of CENP-E, which implicates this protein in delivery of components from kinetochores to poles. CENP-E represents a link between attachment of spindle microtubules and the mitotic checkpoint signalling cascade, as depletion of this motor leads to profound checkpoint activation, whereas immunoprecipitation reveals a nearly stoichiometric association of CENP-E with the checkpoint kinase BubR1 during mitosis. hromosome movements during mitosis are orchestrated primarily by the interaction of spindle microtubules with the kinetochore 1 , the site for attachment of spindle microtubules to the centromere. In addition to providing a physical link between chromosomes and spindle microtubules, the kinetochore has an active function in chromosomal segregation through microtubule motors located at or near i

How Does SUMO Participate in Spindle Organization?

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Régulation de la motilité de Cenp-E, une kinésine associée au kinétochore

Le point de contrôle de l'assemblage du fuseau mitotique va permettre d'empêcher la division cellulaire en cas de mauvais positionnement des chromosomes sur la plaque métaphasique. Parmi les nombreuses protéines impliquées dans cette régulation se trouve la protéine du kinétochore Cenp-E (Centromere associated protein E). Un des enjeux majeur dans l'étude de la mitose est de déterminer quelles sont les protéines du kinétochore qui sont responsables du mouvement des chromosomes. L'objectif de ma thèse a alors été de déterminer quels étaient les mécanismes de régulation de l'activité motrice de la kinésine Cenp-E impliqués dans la dynamique de liaison des microtubules aux kinétochores. Nous avons pu déterminer que la protéine Cenp-E se déplace vers l'extrémité "+" des microtubules. De plus, la partie C-terminale de Cenp-E inhibe directement son activité motrice et cette inhibition est reversée par une phosphorylation par les kinases Mps1 et Cdk1-cycline B. Ces résultats suggèrent un contrôle dynamique de la motilité de Cenp-E et de la congression des chromosomes, dépendant d'une phosphorylation au kinétochoreThe mitotic spindle assembly checkpoint stops cell division in case of incorrect positioning of the chromosomes onto the metaphase plate. This checkpoint avoids inaccurate chromosome division, which could result in a loss or gain of genetic material. Amongst the many proteins involved in this regulation is the kinetochore protein Cenp-E (Centromere associated protein E). One of the biggest goal in the field of mitosis is to establish which kinetochore proteins are responsible of chromosome movement. Therefore the aim of my thesis has been to determine the mechanisms of regulation of the Cenp-E kinesin motor activity involved in the dynamics of binding to the microtubules. We have been able to show that Cenp-E moves towards the "+" end of microtubules. Furthermore, the C-terminal portion of Cenp-E directly inhibits its motor activity and such inhibition is reversed by phosphorylation of the Cterminus by the kinases Mps1 and Cdk1-cyclin B. These results suggest a dynamic control of Cenp-E motility and of chromosome congression, dependent on kinetochore phosphorylationMONTPELLIER-BU Sciences (341722106) / SudocSudocFranceF

Régulation de la phosphorylation de Cenp-E au cours du cycle cellulaire

Au cours du cycle cellulaire, la mitose assure la distribution équitable des chromosomes dupliqués dans une paire de cellules filles. Cette phase est hautement régulée par de nombreuses protéines dont la localisation et l'activité spécifique permettent le bon déroulement de cette étape. Les protéines mitotiques sont elles-mêmes l'objet de régulations, notamment par phosphorylation. Parmi elles, Cenp-E est une kinésine impliquée dans la congression des chromosomes et dans l'activation du point de contrôle dépendant de l'attachement des fuseaux aux kinétochores. Dans la première partie de ce travail de thèse, nous décrivons dans les extraits d'œufs de xénopes quels domaines de Cenp-E lient les kinétochores et la protéine BubR1, dont elle est l'activateur nécessaire à l'activation du point de contrôle mitotique. Par la suite nous décrivons une régulation par phosphorylation sur la sérine 2893 de Cenp-E. Cette phosphorylation, conservée chez l'Homme, est spécifique en mitose et pourrait être attribuée au complexe Cdk1-Cycline B. La phosphorylation sur la sérine 2893 participerait à la levée de l'inhibition exercée par le domaine tail de Cenp-E sur son domaine moteur en restaurant une motilité partielle. La dernière partie de ce travail documente pour la première fois un motif consensus de phosphorylation pour la kinase MPS1, impliquée notamment dans l'activation du point de contrôle de mitose. Ce motif est très proche de celui connu pour PLK1. Nous mettons alors en évidence que certains sites de Cenp-E sont phosphorylés in vitro aussi bien par MPS1 que par PLX1. De plus, l'analyse par spectrométrie de masse a identifié que MPS1 phosphoryle notamment le domaine tail de Cenp-E sur une tyrosine, ce qui n'avait jamais été décrit jusqu'à présent pour les substrats connus de MPS1. Ce travail décrit de nouvelles régulations par phosphorylations sur Cenp-E et attire l'attention sur la similitude des spécificités de substrats pour MPS1 et PLK1During cell cycle, the correct and equal distribution of duplicated chromosomes in each daughter cells occurs in mitosis. Mitosis is performed through high regulations by numerous proteins specified by their localisation and activity. Those proteins are themselves regulated, notably by phosphorylation. Among them, Cenp-E is a kinesin implicated in congression and spindle checkpoint. The first part of this work describe which Cenp-E domains binds to kinetochores and BubR1 kinase, in Xenopus egg extracts. Cenp-E is supposed to be BubR1's activator, nesessary for spindle checkpoint activation. We describe later how Cenp-E is regulated by phosphorylation on serine 2893. This residue is also conserved and phosphorylated specifically during mitosis onto the human protein version. The Cyclin B-Cdk1 complex is likely to be responsible for this phosphorylation wich also takes part in the inhibition release of the Cenp-E motor domain and restores a part of the Cenp-E motility. The last part of this work gives for the first time a phosphorylation consensus sequence of MPS1, a kinase also implicated in spindle checkpoint activation. This consensus motif is very close to the PLK1 one's. In fact Cenp-E can be phosphorylated in vitro onto the same sites by both MPS1 and PLX1. For the first time mass spectrometry analysis identified a tyrosine phosphorylated by MPS1 in vitro, which suggests that MPS1 could be the first identified tyrosine kinase present at the kinetochore. This work describe new regulations on Cenp-E by phosphorylation and warn on the similar substrate specificity shared by MPS1 and PLK1MONTPELLIER-BU Sciences (341722106) / SudocSudocFranceF

Phosphorégulation de l'activité de la kinase Mps1

Mps1 est une protéine kinase à double spécificité impliquée dans le point de contrôle du fuseau mitotique et l'alignement des chromosomes. L'augmentation de l'activité de Mps1 est corrélée avec une augmentation de son niveau de phosphorylation lors de l'entrée en mitose. Cependant, les mécanismes contrôlant cette activation sont inconnus. Nous avons donc cherché à identifier les sites de phosphorylation de Mps1 afin d'étudier leur contribution à la régulation de Mps1. Par spectrométrie de masse, nous avons identifié jusqu'à 27 sites, et nous avons choisi de mutagéniser 11 d'entre eux individuellement en acides aminés non-phosphorylables (alanine), sur la base de leur conservation entre la protéine humaine et de xenope. Nous montrons que trois de ces sites de phosphorylation (S283, T697 et T707) sont essentiels pour l'activité kinase de Mps1, et pour son rôle dans le checkpoint mitotique. Deux de ces sites (T697 et T707) sont localisés dans la boucle d'activation du domaine kinase de Mps1 et sont des sites d'autophosphorylation. La phosphorylation sur le troisième site (S283) requiert une autre kinase. S283 est localisée dans le domaine non-catalytique de Mps1 qui est peu caractérisé et est impliqué dans le recrutement de Mps1 au kinétochore. Nous montrons par immunofluorescence que l'absence de phosphate sur le site S283 ne perturbe pas significativement le recrutement de Mad2 au kinétochore. Enfin, en utilisant des inhibiteurs et l'anticorps spécifique de la phosphorylation du site S283 que nous avons développé, nous montrons que le site S283 est phosphorylé en mitose par CDK, suggérant que les fonctions de Mps1 qui sont spécifiques de la mitose soient régulées par une phosphorylation dépendante des CDKs.Mps1 is a dual-specificity protein kinase involved in the spindle assembly checkpoint and chromosome alignment. Mps1 phosphorylation state and activity increase in mitosis. However, the regulatory mechanisms underlying these observations are unknown. We therefore sought to identify Mps1 phosphorylation sites and to study their contribution to Mps1 regulation. By mass spectrometry we identified up to 27 phosphorylation sites on Mps1. We chose 11 sites that were conserved between Xenopus and human Mps1, and constructed 11 non-phosphorylatable single point mutants. We show that three phosphorylation sites (S283, T697 and T707) are essential for the kinase activity and the checkpoint signalling function of Mps1. Two of these sites (T697 and T707) are located in the activation loop of Mps1 kinase domain and are autophosphorylation sites. Phosphorylation on the third site (S283) results from the activity of an upstream kinase. S283 is located in the less characterized non-catalytic domain that is responsible for the kinetochore localization of Mps1. By immunofuorescence we show that the absence of the phosphate at S283 does not significantly perturb the kinetochore recruitment of the spindle assembly checkpoint component Mad2. Finally, using inhibitors and our developed phosphospecific antibody we demonstrate that Mps1 is phosphorylated at S283 in mitosis by cyclin-dependent kinase (Cdk), suggesting that mitosis specific functions of Mps1 kinase are regulated by Cdk-dependent phosphorylation.MONTPELLIER-BU Sciences (341722106) / SudocSudocFranceF

Bub1 targeting to centromeres is sufficient for Sgo1 recruitment in the absence of kinetochores

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