Controlling Surface-Induced Platelet Activation by Modulation of Contacting Interfaces

Blutplättchen, auch Thrombozyten genannt, sind ein wesentlicher Bestandteil des menschlichen Blutgerinnungssystems. Die Hauptaufgabe der Thrombozyten innerhalb des Körpers besteht in der Blutstillung. Außerhalb des Körpers neigen Thrombozyten jedoch dazu, nach kurzem Kontakt mit synthetischen, nicht physiologischen Oberflächen zu aktivieren, was für viele Anwendungen unerwünscht sein kann, einschließlich der Lagerung von Thrombozyten und der Erforschung der Wechselwirkungen zwischen Thrombozyten und Arzneimitteln. Normalerweise werden Thrombozyten-Konzentrate in handelsüblichen Plastikbeuteln aufbewahrt, die eine große Menge an Weichmachern enthalten, um die Flexibilität des Beutels zu erhöhen und die Möglichkeit eines Bruchs während der Handhabung und des Transports zu vermeiden. Bei längerer Exposition können die giftigen Weichmacher in das Thrombozyten-Konzentrat entweichen. Aktivierte Thrombozyten setzen eine Vielzahl von Proteinen frei, die den Prozess der oberflächeninduzierten Thrombozytenaktivierung (SIPA) weiter unterstützen. SIPA ist eines der Hauptprobleme von Medizinprodukten mit Blutkontakt und Transfusionsgeräten, und ein entscheidender Faktor für die verkürzte Haltbarkeit gelagerter Thrombozyten. Um SIPA zu vermeiden, werden den Thrombozyten-Konzentraten Antikoagulantien zugesetzt, so dass sie bis zu 5 Tage gelagert werden können. Diese Antikoagulantien greifen in die Aktivierungswege der Thrombozyten ein und beeinträchtigen so ihre Funktionalität. Das häufigste Problem bei der Lagerung von Thrombozyten ist schließlich die Gefahr einer bakteriellen Kontamination. Um dieses Problem zu lösen, werden verschiedene UV-Behandlungen eingesetzt, um das Risiko einer Kontamination mit Krankheitserregern zu minimieren. Studien zeigen jedoch, dass diese Strahlung mit kurzer Wellenlänge die Bestandteile der Thrombozytenmembran zerstören und zu einer Aktivierung der Thrombozyten führen kann. Diese zahlreichen, oft miteinander verknüpften Probleme verdeutlichen den dringenden Bedarf an einer effizienten Lösung zur Optimierung der Lagerungsbedingungen für Thrombozyten und zur Maximierung ihrer Lagerfähigkeit. Ziel dieser Doktorarbeit ist es, Oberflächen zu entwickeln, die die Adhäsion von Thrombozyten hemmen und somit ihre Aktivierung und Aggregation verhindern - ohne dass der Zusatz von Antikoagulantien erforderlich ist. Für die Veränderung der Oberflächeneigenschaften stehen drei verschiedene Ansätze zur Verfügung: Biophysikalische, physikochemische oder biochemische Strategien können Verwendet werden, um eine plättchenfreundliche Oberfläche zu gestalten. In der ersten Phase dieses Projekts wurde eine Kombination aus physikochemischen und biophysikalischen Ansätzen angewandt, um Hydrogele aus Gelatine und Agarose herzustellen, die anschließend durch Integration von Eisennanopartikeln zu Nanokompositen verarbeitet wurden. Agarose-basierte Hydrogel-Filme erwiesen sich dabei durch die Kombination von Oberflächenbenetzbarkeit und besseren mechanischen Eigenschaften als ideale Oberflächen. Mikroskopaufnahmen zeigten, dass die Anzahl der Blutplättchen, die an solchen Oberflächen adhärieren, deutlich reduziert und die Ausbreitung der Blutplättchen verhindert wurde. Hergestellte Agarose-Filme und ihre Nanokomposite konnten darüber hinaus bakterielles Wachstum erfolgreich hemmen: Von allen getesteten Proben wurde der höchste Prozentsatz an toten Bakterien auf den Nanokomposit-Filmen gemessen. Die Topographie des Substrats spielt eine entscheidende Rolle für das Verhalten der Zellen und die Kontrolle ihrer Physiologie und Morphologie. Für die Veränderung der Oberflächentopografie stehen zahlreiche komplexe Techniken zur Verfügung. In dieser Arbeit wurden zwei Techniken mit individuellen Vorteilen zur Herstellung von Nanostrukturen eingesetzt. Bei der ersten handelt es sich um ein auf der Rasterkraftmikroskopie (AFM) basierendes Fluidiksystem namens FluidFM, bei dem eine Monomere enthaltende Tinte aus der Öffnung des Cantilever Spitze auf die Oberfläche extrudiert wird. Nach dem Druckvorgang wird die Tinte polymerisiert, um 3D-Strukturen zu erhalten. Mit Hilfe von kontinuierlichen und diskontinuierlichen Topografien wurden hexagonale Bienenstock- bzw. halbkugelförmige Gitterstrukturen hergestellt. Dabei zeigte sich, dass die Thrombozyten diese Strukturierung mechanisch wahrnehmen und ihr Zytoskelett umorganisieren, was zu einer geringeren Ausbreitung der Blutplättchen führt. Darüber hinaus wurde die Technik zum Drucken einer modifizierten biofunktionalisierten Tinte verwendet, die so modifiziert wurde, dass Moleküle mit unterschiedlichen funktionellen Gruppen in die Basistinte integriert wurden. Diese Modifikation führte nur zu einer geringfügigen Veränderung der mechanischen Eigenschaften der gedruckten Strukturen, während ihre Funktionalität erhalten blieb. Die Möglichkeit, Bindungsmotive für spezifische Wechselwirkungen zu integrieren, demonstriert die Vielseitigkeit der FluidFM und ebnet den Weg für die weitere Erforschung des biochemischen/topographischen Ansatzes im Bereich der Entwicklung plättchenfreundlicher Oberflächen. Das Drucken von Mikro- und Nanostrukturen stellt eine schnelle, kostengünstige und effiziente Methode zur Herstellung verschiedener geometrischer Prototypen dar und kann nicht nur zur Untersuchung verschiedener Strukturformen, sondern auch ihrer Größe und anderer topografischer Parameter eingesetzt werden. Die zweite verwendete Technik war die thermische Nanoimprint-Lithografie (T-NIL), mit der ein breiteres Spektrum an Oberflächentopologien untersucht werden konnte, einschließlich Punkt, Kette, Pille und Quadrat-förmiger. Diese Nanomuster wurden auf Siliziumscheiben geätzt und auf einen PDMS-basierten Stempel übertragen, der so zum Prägen von Hydrogelen verwendet werden konnte. Verschiedene Topologien wurden auf die Oberfläche von Agarosegelen geprägt, um ihre zuvor beobachtete, hemmende Wirkung auf die Thrombozytenadhäsion zu verbessern. Das pillenförmige Nanomuster war dabei am besten geeignet, um die Thrombozytenadhäsion zu hemmen, was auf die Höhe der Struktur zurückgeführt werden kann. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass in diesem Projekt Hydrogelfilme auf Agarosebasis, insbesondere in Form von Nanokompositen mit integrierten antibakteriellen Eisennanopartikeln, entwickelt wurden, die Lagerungsbedingungen für Thrombozyten deutlich verbessern, indem sie die SIPA und das Risiko einer bakteriellen Kontamination verringern. UV-Behandlungen von Thrombozyten-Konzentraten werden dadurch überflüssig. Durch die Einführung verschiedener Oberflächentopologien kann die Adhäsion von Thrombozyten gehemmt werden: Das FluidFM-basierte vielseitig einsetybare Nanodrucksystem wurde für die Erforschung und Entwicklung von Prototypen effektiver Geometrien eingesetzt, während T-NIL für die Prägung ausgewählter Strukturen auf die Oberfläche von Agarose-Filmen verwendet werden kann, um eine einheitliche Oberflächentopographie zu schaffen

FluidFM-Based Fabrication of Nanopatterns: Promising Surfaces for Platelet Storage Application

Platelets are cell fragments from megakaryocytes devoid of the cell nucleus. They are highly sensitive and easily activated by nonphysiological surfaces. Activated platelets have an intrinsic mechanism to release various proteins that participate in multiple pathways, initiating the platelet activation cascade. Surface-induced platelet activation is a challenge encountered during platelet storage, which eventually leads to aggregation of platelets and can thereby result in the degradation of the platelet concentrates. We have previously reported that surface-induced platelet activation can be minimized by either modifying their contact surfaces with polymers or introducing nanogroove patterns underneath the platelets. Here, we investigated the response of platelets to various nanotopographical surfaces printed using fluidic force microscopy (FluidFM). We found that the hemispherical array (grid) and hexagonal tile (hive) structures caused a reduction of surface stiffness, which leads to an inhibition of platelet adhesion. Our results reveal that nanopatterns enable the inhibition of platelet activation on surfaces, thus implying that development in nanotexturing of storage bags can extend the lifetime of platelet concentrates

Insights into the writing process of the mask-free nanoprinting fluid force microscopy technology

Platelets are activated immediately when contacting with non-physiological surfaces. Minimization of surface-induced platelet activation is important not only for platelet storage but also for other blood-contacting devices and implants. Chemical surface modification tunes the response of cells to contacting surfaces, but it requires a long process involving many regulatory challenges to transfer into a marketable product. Biophysical modification overcomes these limitations by modifying only the surface topography of already approved materials. The available large and random structures on platelet storage bags do not cause a significant impact on platelets because of their smallest size (only 1-3 μm) compared to other cells. We have recently demonstrated the feasibility of the mask-free nanoprint fluid force microscope (FluidFM) technology for writing dot-grid and hexanol structures. Here, we demonstrated that the technique allows the fabrication of nanostructures of varying features. Characteristics of nanostructures including height, width, and cross-line were analyzed and compared using atomic force microscopy imaging. Based on the results, we identified several technical issues, such as the printing direction and shape of structures that directly altered nanofeatures during printing. We confirmed that FluidFM is a powerful technique to precisely fabricate a variety of desired nanostructures for the development of platelet/blood-contacting devices if technical issues during printing are well controlled

Effect of HIT Components on the Development of Breast Cancer Cells

Cancer cells circulating in blood vessels activate platelets, forming a cancer cell encircling platelet cloak which facilitates cancer metastasis. Heparin (H) is frequently used as an anticoagulant in cancer patients but up to 5% of patients have a side effect, heparin-induced thrombocytopenia (HIT) that can be life-threatening. HIT is developed due to a complex interaction among multiple components including heparin, platelet factor 4 (PF4), HIT antibodies, and platelets. However, available information regarding the effect of HIT components on cancers is limited. Here, we investigated the effect of these materials on the mechanical property of breast cancer cells using atomic force microscopy (AFM) while cell spreading was quantified by confocal laser scanning microscopy (CLSM), and cell proliferation rate was determined. Over time, we found a clear effect of each component on cell elasticity and cell spreading. In the absence of platelets, HIT antibodies inhibited cell proliferation but they promoted cell proliferation in the presence of platelets. Our results indicate that HIT complexes influenced the development of breast cancer cells

Integration of Biofunctional Molecules into 3D-Printed Polymeric Micro-/Nanostructures

Three-dimensional printing at the micro-/nanoscale represents a new challenge in research and development to achieve direct printing down to nanometre-sized objects. Here, FluidFM, a combination of microfluidics with atomic force microscopy, offers attractive options to fabricate hierarchical polymer structures at different scales. However, little is known about the effect of the substrate on the printed structures and the integration of (bio)functional groups into the polymer inks. In this study, we printed micro-/nanostructures on surfaces with different wetting properties, and integrated molecules with different functional groups (rhodamine as a fluorescent label and biotin as a binding tag for proteins) into the base polymer ink. The substrate wetting properties strongly affected the printing results, in that the lateral feature sizes increased with increasing substrate hydrophilicity. Overall, ink modification only caused minor changes in the stiffness of the printed structures. This shows the generality of the approach, as significant changes in the mechanical properties on chemical functionalization could be confounders in bioapplications. The retained functionality of the obtained structures after UV curing was demonstrated by selective binding of streptavidin to the printed structures. The ability to incorporate binding tags to achieve specific interactions between relevant proteins and the fabricated micro-/nanostructures, without compromising the mechanical properties, paves a way for numerous bio and sensing applications. Additional flexibility is obtained by tuning the substrate properties for feature size control, and the option to obtain functionalized printed structures without post-processing procedures will contribute to the development of 3D printing for biological applications, using FluidFM and similar dispensing techniques

Effect of HIT Components on the Development of Breast Cancer Cells

Cancer cells circulating in blood vessels activate platelets, forming a cancer cell encircling platelet cloak which facilitates cancer metastasis. Heparin (H) is frequently used as an anticoagulant in cancer patients but up to 5% of patients have a side effect, heparin-induced thrombocytopenia (HIT) that can be life-threatening. HIT is developed due to a complex interaction among multiple components including heparin, platelet factor 4 (PF4), HIT antibodies, and platelets. However, available information regarding the effect of HIT components on cancers is limited. Here, we investigated the effect of these materials on the mechanical property of breast cancer cells using atomic force microscopy (AFM) while cell spreading was quantified by confocal laser scanning microscopy (CLSM), and cell proliferation rate was determined. Over time, we found a clear effect of each component on cell elasticity and cell spreading. In the absence of platelets, HIT antibodies inhibited cell proliferation but they promoted cell proliferation in the presence of platelets. Our results indicate that HIT complexes influenced the development of breast cancer cells

Effect of Different Crosslinking Strategies on Physical Properties and Biocompatibility of Freestanding Multilayer Films Made of Alginate and Chitosan

Freestanding multilayer films prepared by layer-by-layer technique have attracted interest as promising materials for wound dressings. The goal is to fabricate freestanding films using chitosan (CHI) and alginate (ALG) including subsequent crosslinking to improve the mechanical properties of films while maintaining their biocompatibility. Three crosslinking strategies are investigated, namely use of calcium ions for crosslinking ALG, 1-ethyl-3-(-3-dimethylaminopropyl) carbodiimide combined with N-hydroxysuccinimide for crosslinking ALG with CHI, and Genipin for crosslinking chitosan inside the films. Different characteristics, such as surface morphology, wettability, swelling, roughness, and mechanical properties are investigated showing that films became thinner, exhibited rougher surfaces, had lower water uptake, and increased mechanical strength after crosslinking. Changes of wettability are moderate and dependent on the crosslinking method. In vitro cytotoxicity and cell attachment studies with human dermal fibroblasts show that freestanding CHI-ALG films represent a poorly adhesive substratum for fibroblasts, while studies using incubation of plastic-adherent fibroblast beneath floating films show no signs of cytotoxicity in a time frame of 7 days. Results from cell experiments combined with film characteristics after crosslinking, indicate that crosslinked freestanding films made of ALG and CHI may be interesting candidates for wound dressings