Genome-wide analysis of targets for post-transcriptional regulation by Rsm proteins in Pseudomonas putida

Post-transcriptional regulation is an important step in the control of bacterial gene expression in response to environmental and cellular signals. Pseudomonas putida KT2440 harbors three known members of the CsrA/RsmA family of post-transcriptional regulators: RsmA, RsmE and RsmI. We have carried out a global analysis to identify RNA sequences bound in vivo by each of these proteins. Affinity purification and sequencing of RNA molecules associated with Rsm proteins were used to discover direct binding targets, corresponding to 437 unique RNA molecules, 75 of them being common to the three proteins. Relevant targets include genes encoding proteins involved in signal transduction and regulation, metabolism, transport and secretion, stress responses, and the turnover of the intracellular second messenger c-di-GMP. To our knowledge, this is the first combined global analysis in a bacterium harboring three Rsm homologs. It offers a broad overview of the network of processes subjected to this type of regulation and opens the way to define what are the sequence and structure determinants that define common or differential recognition of specific RNA molecules by these proteins.This work was supported by grants BFU2013-43469-P, BFU2016-80122-P and PID2019-109372GB-I00 from the Plan Estatal de I+D+I (Agencia Estatal de Investigación, Spanish Ministry of Science and Innovation and FEDER funds). Funding from the Biotechnology and Biological Sciences Research Council, United Kingdom (BB/R012415/1), and the University of Malaya (FRGS grant FP022-2018A and HIR grant H-50001-00-A000027) are also gratefully acknowledged

Taxonomic and functional metagenomic profiling of the microbial community in the anoxic sediment of a sub-saline Shallow Lake (Laguna de Carrizo, Central Spain)

The phylogenetic and functional structure of the microbial community residing in a Ca2+-rich anoxic sediment of a sub-saline shallow lake (Laguna de Carrizo, initially operated as a gypsum (CaSO4 × 2 H2O) mine) was estimated by analyzing the diversity of 16S rRNA amplicons and a 3.1 Mb of consensus metagenome sequence. The lake has about half the salinity of seawater and possesses an unusual relative concentration of ions, with Ca2+ and SO 4 2- being dominant. The 16S rRNA sequences revealed a diverse community with about 22% of the bacterial rRNAs being less than 94.5% similar to any rRNA currently deposited in GenBank. In addition to this, about 79% of the archaeal rRNA genes were mostly related to uncultured Euryarchaeota of the CCA47 group, which are often associated with marine and oxygen-depleted sites. Sequence analysis of assembled genes revealed that 23% of the open reading frames of the metagenome library had no hits in the database. Among annotated genes, functions related to (thio) sulfate and (thio) sulfonate-reduction and iron-oxidation, sulfur-oxidation, denitrification, synthrophism, and phototrophic sulfur metabolism were found as predominant. Phylogenetic and biochemical analyses indicate that the inherent physical–chemical characteristics of this habitat coupled with adaptation to anthropogenic activities have resulted in a highly efficient community for the assimilation of polysulfides, sulfoxides, and organosulfonates together with nitro-, nitrile-, and cyanide-substituted compounds. We discuss that the relevant microbial composition and metabolic capacities at Laguna de Carrizo, likely developed as an adaptation to thrive in the presence of moderate salinity conditions and potential toxic bio-molecules, in contrast with the properties of previously known anoxic sediments of shallow lakes.This research was supported by the Spanish CSD2007-00005 project and FEDER funds. M-E.G. thanks the CSIC for a JAE fellowship.Peer Reviewe

Hemorragia Intracerebral en los Pacientes Crónicos Complejos: epidemiología, factores pronósticos, y evitabilidad

La hemorragia intracerebral (ICH) muestra un incremento significativo de su incidencia en sujetos de edad, asociada a comorbilidades, polifarmacia, deterioro cognitivo y envejecimiento con particularidades según el tipo de población estudiado y asociada a un pronóstico de alta mortalidad y discapacidad. El “Paciente Crónico Complejo” (PCC), un subgrupo poblacional emergente, se define por la presencia de esas condiciones asociadas a un mayor riesgo de sufrir una ICH. Disponer de una escala que pudiera facilitar información pronóstica sobre supervivencia a medio y largo plazo tras una ICH, podría facilitar la toma de decisiones relacionadas con la intensidad del tratamiento, y organización de las necesidades, con mayor conocimiento tanto por los profesionales de la salud como por el entorno del paciente. No obstante, la mayoría de escalas para valorar el pronóstico tras sufrir una ICH, son de origen hospitalario con criterios no accesibles desde Atención primaria. Objetivo principal: elaborar una escala pronóstico del riesgo de mortalidad a cinco años después de sufrir una ICH en población general y validarla en la cohorte de pacientes registrados en su historia clínica como PCC en el ámbito de la Atención Primaria. Objetivos secundarios: 1/ Conocer la epidemiología de ICH. 2/ Cuantificar la Mortalidad Innecesariamente Prematura y Sanitariamente Evitable (MIPSE) y conocer las características de la evitabilidad de la ICH. 3/ Identificar factores pronósticos de mortalidad tras sufrir una ICH. 4/ Estratificar el riesgo de mortalidad tras el alta hospitalaria por un episodio ICH en Atención primaria. Hipótesis nula: no hay diferencias en el riesgo de mortalidad después de un episodio ICH entre la población PCC y población general. Material y Métodos. Estudio observacional, multicéntrico, retrospectivo y de base comunitaria, en población general y en una cohorte de población PCC. Información recopilada de la historia clínica electrónica compartida de Cataluña (HC3). Variable principal: muerte por cualquier causa tras un episodio de ICH. Todos los sujetos fueron seguidos desde el alta hospitalaria hasta la muerte o final del estudio. Las variables pronóstico: sociodemográficas; clínicas; valor en índice Charlson y en escalas de Barthel, Rankin, HAS-BLED, Pfeiffer, escala de Gijón score; antecedente de caídas; y número y tipo de fármacos, y estado vital. Inicialmente se realizó un estudio retrospectivo de los pacientes que sufrieron una ICH entre 2006-2016, para identificar las variables asociadas al pronóstico de mortalidad tras una ICH mediante un modelo de Cox multivariante. A partir de las variables significativas, se construyó un modelo predictivo (ICH-AP) que estratificó los pacientes por su riesgo de mortalidad a cinco años (grupos de riesgo bajo, medio y alto). Curvas de mortalidad Kaplan-Meier en cada uno de los grupos de riesgo. Curvas ROC y AUC para evaluar la capacidad de estratificación y predicción del pronóstico. Mediante regresión logística regularizada con validación cruzada diez veces descartándose el veinte por ciento de los datos para evaluar la validez interna. La validación externa se realizó sobre la población PCC del territorio. Con el modelo ICH-AP, se estratificó en grupos de riesgo para realizar el análisis de supervivencia de cada grupo según el método de Kaplan-Meier y su comparación mediante la prueba Log-Rank. Empleamos curvas ROC para valorar la concordancia de nuestro índice con su aplicación sobre la muestra de validación. RESULTADOS PRINCIPALES EN POBLACIÓN GENERAL: Conocer la epidemiología de la (ICH): Se incluyeron 262 casos (58% hombres) con una edad media 73,3±12,4 años. Tiempo medio de seguimiento 1,42 años. Tasa de densidad de incidencia fue de 0,22/1000 personas/año (IC95% 0.20-0.25).43,7% de episodios ocurren >80 años. Incremento exponencial ≥ 55 años en hombres y ≥75 en mujeres. La probabilidad de supervivencia y la autonomía funcional son significativamente inferiores en las mujeres. Se identificaron como factores pronósticos independientes: la edad (OR 1,18 IC95% 1,07-1,29 p <0,001), el tratamiento anticoagulante (OR 4,65 IC95% 1,10-19,6 p 0,036), la polimedicación (OR 1,08 IC95% 1,03-1,13 p 0,001) y el tratamiento con antidepresivos ISRS (OR 9,71 IC95% 1,23-76,68 p 0,031). Cuantificar la Mortalidad Innecesariamente Prematura y Sanitariamente Evitable (MIPSE) y conocer la magnitud y características de la evitabilidad de la ICH. Se utilizó la clasificación MIPSE (Mortalidad Innecesariamente Prematura y Sanitariamente Evitable) que incluye: los traumatismos asociados al episodio de hemorragia en todas las edades, el consumo de alcohol en todas las edades, la hipertensión sistólica (0-74 años) ≥160 mmHg, y la diabetes mellitus (0-49 años). Definición: “incidencia evitable” como aquellos casos de ICH asociada a causas externas que disponen de tratamiento o medidas de prevención y que podrían haberse evitado si el sistema hubiera actuado correctamente en todos sus pasos. Según la clasificación MIPSE, un 40,1% de los casos se asocian a factores evitables, la hipertensión arterial y el traumatismo asociado están presentes en el 89,7% de pacientes que sufren una ICH asociada a factores prevenibles o tratables. La incidencia de ICH evitables significaría el 66,6% de todos los casos <75 años y el 22,7% ≥75 años. Porcentaje total de incidencia evitable 36,6%. Según MIPSE, la evitabilidad de la ICH sería relativamente baja en el periodo de su mayor incidencia ya que parecen estar condicionadas por la interacción de comorbilidades y la decisión de introducir tratamientos, la edad y el sexo. Identificar los factores pronósticos de mortalidad tras sufrir una ICH: La mortalidad global fue 62,2%. Edad media 75,13±12,62 años. La mortalidad general 43,8/100 personas al año; 55,16/100 mujeres y 37,82 / 100 hombres. La tasa de mortalidad más alta fue en pacientes tratados por deterioro cognitivo (85,7%) y/o un mal estado funcional Barthel <60 (84%). Los factores identificados como pronósticos de mortalidad: edad ≥80 años [HR 2,10 (IC95% 1,48-2,99, p <0,001)], deterioro cognitivo [HR 2,04 (IC95% 1,24-3,36, p = 0,005)], Barthel ≤ 60 tras el episodio [HR 3,84 (IC95% 2,51-5,88, p <0,001)], valor HAS-BLED [HR 1,23 (CI95% 1,05-1,44, p = 0,008)] y no tratamiento previo con estatinas [HR 1,47 (IC95% 1,03-2,10, p = 0,032)]. Estratificar el riesgo de mortalidad después del alta hospitalaria por un episodio ICH en Atención primaria: la puntuación media en el modelo ICH-AP: 5,58±1,95 (rango0-10). Se obtuvieron tres grupos de riesgo: Grupo (L1) bajo riesgo (0 a 1 punto): 46 pacientes (17,6%). Muertes 7 (15,21%). Grupo (L2) riesgo medio (2 a 5 puntos): 113 pacientes (43,1%). Muertes 70 (65,4%). Grupo (L3) alto riesgo (6 o más puntos): 103 pacientes (39,31%). Muertes 86 (83,5%).El valor del índice AUC: 0,892 (95% 0,850- 0,934), mostrando buen poder predictivo. Para los niveles de riesgo, el valor AUC fue: bajo riesgo, 0,97 (IC del 95%: 0,92-1); riesgo intermedio, 0,83 (IC del 95%: 0,75-0,92); y alto riesgo, 0,85 (IC del 95%: 0,76-0,93). La probabilidad media de supervivencia a 5 años en el grupo de bajo riesgo es del 80,8% (IC del 95%: 0,67-0,96); 33,6% (IC del 95%: 0,24-0,45) en el riesgo medio; y el 12,8% (95% 6,9-23,6) en el de alto riesgo. El análisis comparativo de la supervivencia de los tres grupos de riesgo muestra Log-Rank p <0,0001. OBJETIVO PRINCIPAL: elaborar una escala pronóstico del riesgo de mortalidad después de una ICH en población general y validación en PCC en el ámbito de la Atención Primaria. RESULTADOS EN POBLACIÓN PCC:3.594 pacientes sin ICH previa seguidos prospectivamente en el período 01/01/2013-12/31/2017. 161 casos de ICH (55,9% mujeres) y densidad de incidencia de ICH 15,0/1000 personas/año (IC95% 12,8-17,5). Edad media 86,1±8,4 años. Tiempo medio de seguimiento 3,89 años (IC95% 3,84-93). Valor medio en el modelo ICH-AP 4,57 ± 2,39. Tasa de mortalidad general 58,4%. La prevalencia de comorbilidades fue similar por sexo, aunque las mujeres eran mayores (p 3 como medición del riesgo de sangrado, se mantuvieron como factores pronósticos independientes de mortalidad tanto en población general como en PCC. CONCLUSIONES: 1. El índice ICH-AP es una escala clínicaque puede usarse para mejorar lapredicción pronóstico de mortalidad en atención primaria tras un episodio de ICH. El AUC fue 0,89 (IC 95% 0,85-0,93). 2. La edad, estado funcional, HAS-BLED, deterioro cognitivo, y no tratamiento previo con estatinas, se identifican como factores pronósticos de mortalidad a largo plazo en población general que ha sufrido una ICH. 3. Existen diferentes patrones de mortalidad tras sufrir un ICH entre población general y PCC por lo que se deberían investigar sobre aspectos particulares asociados a este grupo poblacional. 4. Solo la edad y el valor HAS-BLED se mantuvieron como factores pronósticos independientes de mortalidad en población general y en PCC. 5. El índice ICH-AP no resultó significativo en la validación externa en población PCC, posiblemente debido a diferencias en la edad, y comorbilidades asociadas al riesgo de sangrado en dicha población. Investigaciones futuras deberían definir qué escala de riesgo de sangrado sería más útil para detectar PCC con alto riesgo de ICH y qué medidas preventivas serían más efectivas en modificación de los factores de riesgo evitables

Cellular L-arginine pools modulate c-di-GMP turnover and biofilm formation in Pseudomonas putida

1 página.- Abstract del poster presentado al Congreso Biofilms 9 celebrado en Karlsruher, Institut für Technologie (KIT), Alemania, del 29 de septiembre al 1 de octubre 2020The intracellular second messenger cyclic diguanylate (c-di-GMP) is broadly conserved in bacteria, where it influences processes such as virulence, stress resistance and biofilm development. In the plant-beneficial bacterium Pseudomonas putida KT2440, the response regulator with diguanylate cyclase activity CfcR is the main contributor to c-di-GMP levels in the stationary phase of growth. When overexpressed, CfcR increases c-di-GMP levels and gives rise to a pleiotropic phenotype that includes enhanced biofilm formation and crinkly colony morphology. Our group has previously reported that insertion mutants in argG and argH, the genes that encode the last two enzymes in the arginine biosynthesis pathway, do not display the crinkly colony morphology phenotype and show decreased c-di-GMP levels even in the presence of cfcR in multicopy (Ramos-González, M.I. et al. 2016. Front. Microbiol. 7, 1093). Here we present results indicating that L-arginine acts both as an environmental and as a metabolic signal that influences the lifestyles of P. putida through the modulation of c-di-GMP levels and changes in the expression of structural elements of biofilms. Exogenous L-arginine partially restores c-di-GMP levels in arginine biosynthesis mutants, a response that is transduced through CfcR and possibly (an)other diguanylate cyclase(s). At least three periplasmic binding proteins, each forming part of an amino acid transport system, contribute in different ways to the response to external L-arginine. We propose that the turnover of the second messenger c-di-GMP is modulated by the state of global arginine pools in the cell resulting both from anabolism and from uptake

The transcriptional regulator ArgR links cellular arginine pools and c-di-GMP signaling in Pseudomonas putida KT2440

Resumen del poster presentado en: XIII Reunión del Grupo de Microbiología Molecular de La SEM. Granada, 7-9 septiembre (2022)This work is funded by grant PID2019-109372GB-I00 (MCIN/AEI/10.13039/501100011033

Arginine as an environmental and metabolic cue for cyclic diguanylate signalling and biofilm formation in Pseudomonas putida

Cyclic diguanylate (c-di-GMP) is a broadly conserved intracellular second messenger that influences different bacterial processes, including virulence, stress tolerance or social behaviours and biofilm development. Although in most cases the environmental cue that initiates the signal transduction cascade leading to changes in cellular c-di-GMP levels remains unknown, certain l- and d-amino acids have been described to modulate c-di-GMP turnover in some bacteria. In this work, we have analysed the influence of l-amino acids on c-di-GMP levels in the plant-beneficial bacterium Pseudomonas putida KT2440, identifying l-arginine as the main one causing a significant increase in c-di-GMP. Both exogenous (environmental) and endogenous (biosynthetic) l-arginine influence biofilm formation by P. putida through changes in c-di-GMP content and altered expression of structural elements of the biofilm extracellular matrix. The contribution of periplasmic binding proteins forming part of amino acid transport systems to the response to environmental l-arginine was also studied. Contrary to what has been described in other bacteria, in P. putida these proteins seem not to be directly responsible for signal transduction. Rather, their contribution to global l-arginine pools appears to determine changes in c-di-GMP turnover. We propose that arginine plays a connecting role between cellular metabolism and c-di-GMP signalling in P. putida.This work was funded by grants BFU2016-80122-P from the Plan Estatal de I+D+I and P11-CVI-7391 from Junta de Andalucía, and EFDR funds. L.B.-M. was the recipient of a predoctoral contract from Junta de Andalucía

Arginine Biosynthesis Modulates Pyoverdine Production and Release in Pseudomonas putida as Part of the Mechanism of Adaptation to Oxidative Stress.

Iron is essential for most life forms. Under iron-limiting conditions, many bacteria produce and release siderophores—molecules with high affinity for iron—which are then transported into the cell in their iron-bound form, allowing incorporation of the metal into a wide range of cellular processes. However, free iron can also be a source of reactive oxygen species that cause DNA, protein, and lipid damage. Not surprisingly, iron capture is finely regulated and linked to oxidative-stress responses. Here, we provide evidence indicating that in the plant-beneficial bacterium Pseudomonas putida KT2440, the amino acid l-arginine is a metabolic connector between iron capture and oxidative stress. Mutants defective in arginine biosynthesis show reduced production and release of the siderophore pyoverdine and altered expression of certain pyoverdine-related genes, resulting in higher sensitivity to iron limitation. Although the amino acid is not part of the siderophore side chain, addition of exogenous l-arginine restores pyoverdine release in the mutants, and increased pyoverdine production is observed in the presence of polyamines (agmatine and spermidine), of which arginine is a precursor. Spermidine also has a protective role against hydrogen peroxide in P. putida, whereas defects in arginine and pyoverdine synthesis result in increased production of reactive oxygen species. IMPORTANCE The results of this study show a previously unidentified connection between arginine metabolism, siderophore turnover, and oxidative stress in Pseudomonas putida. Although the precise molecular mechanisms involved have yet to be characterized in full detail, our data are consistent with a model in which arginine biosynthesis and the derived pathway leading to polyamine production function as a homeostasis mechanism that helps maintain the balance between iron uptake and oxidative-stress response systems.This work was funded by grants BFU2016-80122-P from the Plan Estatal de I+D+I and P11-CVI-7391 from Junta de Andalucía and by EFDR funds. L.B.-M. was the recipient of a predoctoral contract from Junta de Andalucía

C-di-GMP and biofilm are regulated in Pseudomonas putida by the CfcA/CfcR two-component system in response to salts

In Pseudomonas putida KT2440, cfcR encodes an orphan multidomain response regulator with diguanylate cyclase activity, which is responsible for the synthesis of c-di-GMP, a second messenger key in the transition from planktonic to sessile bacterial lifestyles. When overexpressed, cfcR enhances biofilm formation and causes other phenotype alterations. The cfcA gene, encoding a membrane-anchored multisensory CHASE3/GAF hybrid histidine kinase (HK), is required to develop this pleiotropic phenotype. Here we show autophosphorylation of CfcA through HisKA/HATPase_c domains and then transfer of the phosphoryl group to an internal receiver (REC) domain. CfcA REC domains are nonessential for phosphotransfer from CfcA~P to the REC domain of CfcR. CfcA~P also phosphorylates the REC domain of CfcD, a second HK encoded in the same gene cluster as CfcA, which negatively regulates the CfcA/CfcR pathway. To evaluate the impact of CfcA domains on CfcR activity, a battery of mutants with in-frame domain deletions was generated, whose CfcA protein locations were also examined. CfcA membrane anchorage contributes to protein stability and CfcR activation. Salt enhances c-di-GMP levels through CfcR, a response which is hampered by alteration of a presumed ligand-binding motif in the CHASE3 sensor domain. Thus, in P. putida, c-di-GMP is salt-regulated through the CfcA/CfcR/CfcD system.This study was funded by grants BFU2016-80122-P and PID2019-109372GB-I00 from MICIN/AEI//10.13039/501100011033 and FEDER ‘Una manera de hacer Europa’. We wish to thank Michael O'Shea for proofreading the article and Juan L. Ramos for his critical reading of the manuscript. We also thank the anonymous reviewers for their useful comments and suggestions to improve the quality of the manuscript

Diferencias en la supervivencia después de un episodio de ictus tratado con fibrinólisis. Estudio Ebrictus

Objetivo: Investigar la relación entre género y supervivencia después de un episodio de ictus tratado con fibrinólisis. Diseño: Estudio de cohortes. Emplazamiento: Atención primaria. Participantes: Los casos tratados con fibrinólisis por un ictus agudo desde el 1 de abril de 2006 al 13 de septiembre de 2013. Intervenciones: Seguimiento del estado vital. Mediciones principales: Riesgos vasculares: escala Framingham, REGICOR, CHA2DS2-VASc, Essen, NIHSS, índice Barthel; densidad de incidencia; análisis de supervivencia por Kaplan-Meier; bivariado entre supervivientes y fallecidos; y multivariante de Cox. Resultados: Noventa y un pacientes con edad media 68,02 ± 11,9 años. Los hombres tienen mayor riesgo cardiovascular basal. El tiempo medio de seguimiento fue de 2,95 ± 2,33 años. La razón de tasa de incidencias mostró un mayor riesgo en los hombres respecto a las mujeres IR = 3,2 (IC 95%: 1,2-8,0). Los fallecidos en relación con los supervivientes son mayores (p = 0,032); mayor riesgo cardiovascular basal (p = 0,040) y de recidiva de ictus (p < 0,001); mayor severidad del episodio (p = 0,002); y una mayor caída en la puntuación Barthel un año después del ictus (p = 0,016). El porcentaje de muertes es significativamente más alto cuando el paciente es derivado a centros de agudos o de larga estancia (p = 0,006) que cuando se deriva al domicilio, pero solo el género (HR: 1,12; IC 95%: 1,05-1,20) y la prevención cardiovascular secundaria (HR: 0,13; IC 95%: 0,06-0,28) se asociaron con la mortalidad de los pacientes. Conclusiones: Después de un episodio de ictus tratado con fibrinólisis los hombres tienen un 12% más de riesgo de morir que las mujeres, y la ausencia de prevención cardiovascular secundaria aumenta 7,7 veces el riesgo de mortalidad

Sex Differences in Long-Term Survival after a First Stroke with Intravenous Thrombolysis: Ebrictus Study

Background: A number of large trials have confirmed the benefits of thrombolysis in acute stroke, but there are gender differences. We sought to examine the relationship between sex and outcome after thrombolysis. Methods: This was a prospective cohort study including 1,272 incident ischemic strokes (597 in women) from April 1, 2006 to December 31, 2014. Statistical approaches were used for analyzing survival outcomes and their relationship with thrombolysis therapy. Results: The death rates were lower (p = 0.003) in the thrombolysis therapy group with an incidence ratio of 0.57 (95% CI 0.39-0.83). 113 (8.8%) patients (53 women) received thrombolysis. They were significantly younger (69.2 ± 12.7 vs. 73.9 ± 12.5 years; p Conclusions: The stroke death rates were lower in women after thrombolysis treatment and suggest significant benefit for women in this setting. The overall benefit on survival of the patients treated with thrombolysis might be explained by the beneficial effect of the thrombolysis on the women