Plant surfaces as vehicles of Bacillus cereus responsible of human food poisoning

• Introduction A major concern in food safety is the contamination of fresh and stored food with spoiling bacteria that provoke human poisoning. Bacillus cereus is a common food-borne pathogen responsible of important poisoning outbreaks and severe bacteraemia and septicaemia. Poisoning caused by B. cereus is classified in two main categories: emetic and diarrheic. The emetic poisoning is correlated to the production of cereulide. This toxin is very heat stable, and it can be produced in the food contaminated by B. cereus cells. Diarrheic poisoning is provoked by the enterotoxin hemolysin BL, the non-hemolytic enterotoxin and the cytotoxin K. • Objective To study the interaction of B. cereus with plants as a bacteria reservoir, and in ready-to-eat fruits and vegetables. • Materials & Methods A collection of strains implicated in food-borne outbreaks were tested in vitro for a battery of phenotypes related to bacterial multicellular behaviour and thus interaction with host. 1. Solid or liquid media were used to study biofilm formation, motility or adhesion to surfaces. 2. Leaves, fruits and vegetables (melon leaf, cucumber leaf and fruit and endive) were used to study the persistence of B. cereus over time and their distribution and organization by electron microscopy. • Results All the strains behaved similarly in vitro, only some persisted on plant surfaces. Among them, the emetic strain AH187 was selected because bacterial cells persisted on a concentration of 104-105 CFU per gram of leaf, vegetable or fruit, with a sporulation rate of 40%. The electron microscopy images showed the organization of bacteria in well-developed biofilms with visible extracellular matrix. Finally, mass spectrometry analysis proved the presence of some isoforms of cereluide on the different surfaces. • Conclusion The fact that cells of B. cereus persist in leaf surface mainly as vegetative cells are indicative of their ability to adapt to the physico-chemical changeable phyllosphere, and thus to produce the emetic toxin cereulide. The presence of spores, and the formation of biofilms can be indicative of the versatile adhesive properties of this strain to diverse surfaces. Altogether are supportive of the importance of plant surfaces either as reservoir of bacterial cells or as vehicles for further contamination and food poisoning.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Estudio de la interacción de Bacillus cereus responsable de intoxicaciones eméticas en humanos con la superficie de hojas y frutos.

Bacillus cereus es una bacteria patógena de humanos que comúnmente se transmite por la ingesta de alimentos contaminados causando importantes brotes de intoxicación alimentaria. La persistencia y colonización de esta bacteria en frutos y vegetales supone un grave problema en la industria médica y alimentaria. En este trabajo, se ha estudiado el comportamiento de diferentes aislados procedentes de intoxicaciones alimentarias sobre la superficie de frutos y hojas de plantas como posibles vehículos de estos microorganismos a través de los cuales se producirían las toxiinfecciones alimentarias. Todos los aislados fueron inicialmente estudiados in vitro para una batería de fenotipos relacionados con el comportamiento multicelular bacteriano: Formación de biofilm, movilidad swarming/sliding o adhesión a superficie. De entre todos los aislados se seleccionaron aquellos con características distintivas (morfología de colonia, fuerte adhesión a las paredes de pocillos, o formación de película en la interfase aire-líquido) para estudios de interacción con plantas. En general no observamos una correlación entre el comportamiento in vitro y los resultados en planta, por lo que decidimos seleccionar una cepa emética por varios motivos: i) produce la toxina emética cereulide, y una enterotoxina no hemolítica, siendo por tanto de gran interés en seguridad alimentaria, ii) en las distintas plantas ensayadas se mantuvo a concentraciones de 105 UFC por gramo de hoja inoculada de los que un 40% apareció en la forma de esporas y iii) es una cepa manipulable genéticamente. Uno de los resultados más interesantes fue la aparición de un mutante espontáneo en la fracción más externa de la una colonia de la cepa emética crecida en medio de movilidad swarming. Este mutante daba lugar a una colonia con morfología totalmente diferente y mayor capacidad de movilidad. En los ensayos en planta, el mutante se comportó como el silvestre en cuanto a persistencia, formación de biofilm, o esporulación. La comparativa de los genomas sin embargo mostró la pérdida masiva de elementos transponibles, así como otros locus no caracterizados previamente. Con todos estos datos en nuestras manos nos encontramos posicionados para comprender que herramientas, conocidas o aún por conocer, utiliza esta cepa para interaccionar con la planta, y de qué forma coordina su persistencia con una eventual producción de toxinas que tienen como diana al hombre. Este trabajo está financiado por European Research Council-Starting Grant-2014 (8.06 UE/60.8003).Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Interacción de aislados de Bacillus cereus responsables de toxoinfecciones alimentarias con la filosfera

Bacillus cereus es un grupo heterogéneo de bacterias Gram-positivas que incluyen cepas patógenas responsables de contaminaciones en la industria alimentaria y médica, así como intoxicaciones alimentarias. Dependiendo de los síntomas asociados a la intoxicación, las cepas patógenas de B. cereus pueden clasificarse en enterotoxigénicas y eméticas, existiendo también cepas ambientales con actividad de biocontrol. Además, esta bacteria forma biopelículas, lo que puede contribuir a una eficiente colonización de superficies incluidas las de plantas, un aspecto poco estudiado del ciclo de vida de B. cereus. En este trabajo se seleccionaron 10 aislados clínicos y ambientales de B. cereus, debido a las diferencias en su capacidad para formar biopelículas in vitro. Para estudiar la ecología de estas cepas, se inocularon hojas de plantas de melón y pepino con suspensiones de 108 ufc/ml de cada cepa. La dinámica de población demostró que prácticamente todos los aislados persistían en las hojas a niveles de 103 ufc/g de hoja, aunque no parecía existir un patrón asociado al origen del aislamiento. Sin embargo, pudimos observar tres cinéticas de esporulación diferentes: esporulación temprana de la población, esporulación tardía y prácticamente ausencia de esporulación. El seguimiento de la distribución espacial de las bacterias mediante microscopía electrónica de barrido mostró la existencia de colonias formadas por varias capas de células unidas entre sí por una especie de matriz, sugerente de biopelículas bacterianas. Nuestros resultados prevén la capacidad de cepas patógenas de humanos de B. cereus de vivir en la filosfera de plantas como lo haría una cepa de origen ambiental, usando para ello la formación de biopelículas, la esporulación o una combinación de ambas estrategias. Si bien, las hojas de las plantas ensayadas no entrarían en la cadena alimenticia del hombre, si representarían un reservorio importante desde donde podrían pasar a los frutos que se consumen.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Estudio de la interacción de Bacillus cereus responsable de intoxicaciones alimentarias en humanos con la superficie de hojas y frutos

Bacillus cereus es un patógeno humano bastante común que se transmite por alimentos y es responsable de importantes brotes de intoxicación alimentaria. El desarrollo de la enfermedad emética está relacionado con la producción de la toxina termo-resistente cereulide, que normalmente se produce en los alimentos contaminados por B. cereus. La enfermedad diarreica es provocada por varias enterotoxinas: la hemolisina BL (Hbl), la enterotoxina no hemolítica (Nhe) y la citotoxina K (CytK) . En este trabajo, se ha estudiado el comportamiento de diferentes aislados, procedentes de intoxicaciones alimentarias, sobre la superficie de frutos y hojas de plantas como posibles vehículos de estos microorganismos a través de los cuales se producirían las toxiinfecciones alimentarias. De entre todos los aislados seleccionados se eligió un grupo de 8 aislados, seis de los cuales eran capaces de persistir en hoja y fruto y los otros dos no, que se secuenciaron y se buscó los grupos de genes que eran compartidos por los diferentes aislados capaces de persistir sobre las superficies y que sin embargo no están presentes en los aislados que no son capaces de persistir. Para el posterior estudio de la relevancia de estos grupos de genes en la persistencia en hoja y fruto, se seleccionó una cepa emética del estudio por varios motivos: i) produce la toxina emética cereulide, y una enterotoxina no hemolítica, siendo por tanto de gran interés en seguridad alimentaria, ii) en las distintas plantas ensayadas se mantuvo a concentraciones de 105 UFC por gramo de hoja o fruto inoculado de los que al menos un 40% apareció en la forma de esporas y iii) es una cepa manipulable genéticamente. Con todos estos datos, nos encontramos posicionados para comprender que herramientas, conocidas o aún por conocer utiliza esta cepa para interaccionar con la planta y frutos, y de qué forma coordina su persistencia con una eventual producción de toxinas que tienen como diana al hombre

Evolución genómica de morfotipos espontáneos en colonias de Bacillus cereus.

Bacillus cereus es una bacteria responsable de importantes brotes de intoxicación alimentaria. La persistencia a través de la generación de biofilm y colonización de esta bacteria en frutos y vegetales supone un grave problema en la industria médica y alimentaria. Estudios previos revelan que durante la evolución en entornos estructurados como los biofilms, las poblaciones isogénicas tienden a diversificarse en variantes fenotípicas genéticamente distintas, que influyen en gran medida en la interacción con el resto de la población. Estudios previos en nuestro laboratorio han confirmado la aparición de mutantes espontáneos en las fracciones más externas de colonias de la cepa emética de B. cereus crecida en medio de movilidad swarming de forma recurrente. Este mutante da lugar a una colonia con morfología totalmente diferente y mayor capacidad de movilidad, originando un “punto de fuga” del biofilm. Estos morfotipos también fueron hallados in vivo en la supeficie de hojas de melón en inoculaciones realizadas en el laboratorio. La aparición de este tipo de mutantes ha estado asociada tradicionalmente al hecho de que la diversificación evolutiva tiende a mejorar la productividad de los biofilms, ya que las variantes recién surgidas se especializan en ocupar diferentes nichos, reduciendo así la competencia. Pero la historia evolutiva a nivel genético de estos morfotipos aun presenta grandes lagunas de conocimiento. Para profundizar en esta cuestión hemos desarrollado un flujo de trabajo llamado BacRiavility con el que se analizaron SNPs, recombinaciones, variantes estructurales, InDels y reorganizaciones genómicas de los diferentes morfotipos encontrados en placa y en plantas a partir de secuenciación masiva del genoma de diferentes morfotipos de colonias. Los resultados mostraron patrones comunes de mutaciones y cambios genómicos asociados a elementos de la matriz en todas las muestras analizadas.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tec

Implicación de la matriz extracelular de biofilms de Bacillus subtilis en la interacción beneficiosa con la planta

Los biofilms bacterianos están constituidos por comunidades de células unidas entre sí por una matriz extracelular polimérica. Los componentes de la matriz extracelular pueden variar dependiendo de la cepa bacteriana, pero en general se puede decir que está constituida por proteínas, exopolisacáridos y/o ácidos nucleicos. La matriz extracelular es un tejido multifuncional que contribuye a: la arquitectura final del biofilm, la regulación del flujo de nutrientes y gases dentro del biofilm, la interacción con las superficies, y la protección de las células frente a agentes tóxicos externos. Aunque son numerosos los estudios que se han centrado en el papel de la matriz en la virulencia de bacterias patógenas de humanos, este tejido polimérico puede ser igualmente importante en la interacción beneficiosa de un agente de biocontrol con la planta. Tanto para el desarrollo de la actividad de biocontrol como para la promoción del crecimiento radicular es necesaria la colonización y persistencia del microorganismo sobre la superficie de la planta, y la pregunta es hasta qué punto es importante la formación de biofilms. En este estudio trabajamos con cepas de Bacillus como agentes de control biológico (BCA) frente a enfermedades de cucurbitáceas y a su vez promotoras del crecimiento radicular (PGPR por sus siglas en inglés plant growth promoting rhizobacteria). Valiéndonos de una batería de mutantes en distintos elementos estructurales y funcionales de la matriz extracelular, estudiamos los patrones de colonización y persistencia de estas cepas en filosfera y rizosfera y evaluamos su efecto sobre la actividad PGPR. Las diferencias observadas entre algunos mutantes de matriz en cuanto a la dinámica de población y la distribución espacial en los dos nichos de estudio, así como en su actividad PGPR, apuntan a su relevancia en la ecología y funcionalidad de estos agentes de biocontrol.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

The putative different roles of TasA and CalY in the biofilm formation of B. cereus

Bacillus cereus is a human pathogen responsible of many food poisoning due to the ingestion of contaminated vegetables or processed foods. The biofilm development and spore formation, are essential stages in the survival and transmission of the bacteria and hence the production of harmful toxins for the consumer. During the biofilm formation, a subpopulation is differentiated to extracellular matrix producers, mainly composed by exopolysaccharides, proteins and extracellular DNA. One of the most fascinating compounds of this matrix are the amyloid proteins, that shows a high tendency to fibrillate and have a multifunctional role in the bacterial physiology. In earlier studies it was identified that B. cereus possess two orthologues genes to the tasA gene in B. subtilis, initially described as essential in the assembly of amyloid fibers, and they were named as tasA and calY respectively. Both genes are located in the same genomic region and the deletion of each one leads to a different phenotype related with a deficient biofilm. In the case of the tasA mutant the biofilm finally detaches from the well at 72 hours, and the calY mutant shows a thinner ring phenotype in comparison with the wild type strain. Those preliminary results could indicate that TasA and CalY have different roles in the biofilm formation. The level of tasA and calY expression in the biofilm was higher than in planktonic cells, and it could be differentiated three different subpopulations: both genes are expressed, only calY or none of them. Amyloid proteins have been described as being involved in adhesion and host-colonization. A study of the dynamic of tasA gene expression show that is influenced by the type of vegetable surface.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Multiancestry analysis of the HLA locus in Alzheimer’s and Parkinson’s diseases uncovers a shared adaptive immune response mediated by HLA-DRB1*04 subtypes

Across multiancestry groups, we analyzed Human Leukocyte Antigen (HLA) associations in over 176,000 individuals with Parkinson’s disease (PD) and Alzheimer’s disease (AD) versus controls. We demonstrate that the two diseases share the same protective association at the HLA locus. HLA-specific fine-mapping showed that hierarchical protective effects of HLA-DRB1*04 subtypes best accounted for the association, strongest with HLA-DRB1*04:04 and HLA-DRB1*04:07, and intermediary with HLA-DRB1*04:01 and HLA-DRB1*04:03. The same signal was associated with decreased neurofibrillary tangles in postmortem brains and was associated with reduced tau levels in cerebrospinal fluid and to a lower extent with increased Aβ42. Protective HLA-DRB1*04 subtypes strongly bound the aggregation-prone tau PHF6 sequence, however only when acetylated at a lysine (K311), a common posttranslational modification central to tau aggregation. An HLA-DRB1*04-mediated adaptive immune response decreases PD and AD risks, potentially by acting against tau, offering the possibility of therapeutic avenues

Common variants in Alzheimer’s disease and risk stratification by polygenic risk scores

Genetic discoveries of Alzheimer’s disease are the drivers of our understanding, and together with polygenetic risk stratification can contribute towards planning of feasible and efficient preventive and curative clinical trials. We first perform a large genetic association study by merging all available case-control datasets and by-proxy study results (discovery n = 409,435 and validation size n = 58,190). Here, we add six variants associated with Alzheimer’s disease risk (near APP, CHRNE, PRKD3/NDUFAF7, PLCG2 and two exonic variants in the SHARPIN gene). Assessment of the polygenic risk score and stratifying by APOE reveal a 4 to 5.5 years difference in median age at onset of Alzheimer’s disease patients in APOE ɛ4 carriers. Because of this study, the underlying mechanisms of APP can be studied to refine the amyloid cascade and the polygenic risk score provides a tool to select individuals at high risk of Alzheimer’s disease

New insights into the genetic etiology of Alzheimer’s disease and related dementias

Characterization of the genetic landscape of Alzheimer’s disease (AD) and related dementias (ADD) provides a unique opportunity for a better understanding of the associated pathophysiological processes. We performed a two-stage genome-wide association study totaling 111,326 clinically diagnosed/‘proxy’ AD cases and 677,663 controls. We found 75 risk loci, of which 42 were new at the time of analysis. Pathway enrichment analyses confirmed the involvement of amyloid/tau pathways and highlighted microglia implication. Gene prioritization in the new loci identified 31 genes that were suggestive of new genetically associated processes, including the tumor necrosis factor alpha pathway through the linear ubiquitin chain assembly complex. We also built a new genetic risk score associated with the risk of future AD/dementia or progression from mild cognitive impairment to AD/dementia. The improvement in prediction led to a 1.6- to 1.9-fold increase in AD risk from the lowest to the highest decile, in addition to effects of age and the APOE ε4 allele