Sepelvaltimotautipotilaiden maksan mikroRNA-profiilin määrittäminen iPS-soluista erilaistettujen maksasolujen avulla

Sepelvaltimotauti on yleisimpiä kuolinsyitä maailmanlaajuisesti. Sepelvaltimotautia aiheuttaa ateroskleroosi, jossa valtimon seinämään kertyy vuosikymmenien saatossa muun muassa kolesterolista ja tulehdussoluista koostuva plakki, joka ahtauttaa verisuonta. Osa muodostuneista plakeista on hauraita ja ne voivat revetessään aiheuttaa sydäninfarktin ja äkkikuoleman. Kaikilla potilailla plakki ei repeydy, vaan heillä plakki on paksun fibroottisen katon peitossa. Tärkeää olisi tunnistaa ne henkilöt, joilla plakki voi revetä ja joilla siis on suurentunut sydäninfarkti- ja äkkikuolemariski. MikroRNA:t (miRNA:t) ovat lyhyitä ei-koodaavia RNA-molekyylejä, jotka voivat sitoutua lähetti-RNA:han, mikä yleensä johtaa vastaavan geenin transkription jälkeiseen vaimentumiseen. Maksassa miRNA:t säätelevät muun muassa lipoproteiini- ja kolesteroliaineenvaihduntaa, lipidien aineenvaihduntaa sekä insuliinin signalointia. Nämä aineenvaihduntareitit ovat usein epätarkoituksenmukaisesti säädeltyjä aineenvaihduntahäiriöissä kuten rasvamaksassa ja tyypin 2 diabeteksessa, jotka liittyvät läheisesti sepelvaltimotautiin. Maksan rooli hauraan ateroskleroottisen plakin kehittymisessä on kuitenkin edelleen epäselvä. Maksasolujen kaltaisia soluja on mahdollista erilaistaa uudelleenohjelmoiduista, erittäin monikykyisistä kantasoluista (engl. induced pluripotent stem cell, iPS-solu), mikä mahdollistaa potilaiden maksasolujen tutkimisen ilman invasiivistä maksakoepalan ottoa. Tässä työssä pyrin löytämään potilaiden iPS-soluista erilaistettujen maksasolujen avulla uusia ateroskleroosille altistavia miRNA-molekyylejä, joita voitaisiin käyttää sairauden mekanismien tutkimiseen ja diagnostiikan kehittämiseen. Erilaistin maksasoluja 27:stä iPS-solulinjasta, jotka olivat peräisin 15:sta tutkimushenkilöstä, joilla oli stabiili sepelvaltimotauti (n = 5), akuutti sepelvaltimotauti (n = 5) tai terveet sepelvaltimot (n = 5). Suoritin miRNA-mikrosiruseulontaa maksaerilaistumisen ajan sekä vertailin potilasryhmien erilaistettujen maksasolujen miRNA-profiileja tunnistaakseni sepelvaltimotaudin kehittymiseen osallistuvia miRNA:ita. MikroRNA-profiili muuttui maksaerilaistumisen aikana ja muistutti lopuksi ihmisen primääristen maksasolujen profiilia. Mikrosirututkimuksessa 35 miRNA:ta oli tilastollisesti merkitsevästi poikkeavasti ilmentyviä akuuteilla ja 87 stabiileilla sepelvaltimotautipotilailla verrattuna kontrolleihin. Lisäksi qPCR:n avulla todettiin miR-149-5p:n, -92a-3p:n ja -221-3p:n vähentyminen ja miR-122-5p:n lisääntyminen stabiileilla sepelvaltimotautipotilailla verrattuna muihin ryhmiin. Poikkeavasti ilmentyvien miRNA:iden ennustetut säätelykohteet rikastuivat insuliinisignalointiin, tulehdukseen ja lipidiaineenvaihduntaan liittyvillä aineenvaihduntareiteillä. Stabiilien sepelvaltimotautipotilaiden sepelvaltimoissa oli paljon ateroskleroosia ja näiden potilaiden maksasoluilla oli selvästi erottuva geneettinen miRNA-profiili, joka mahdollisesti liittyy maksan aineenvaihduntahäiriöön. Tämä puolestaan voi selittää alttiutta sepelvaltimotaudin kehittymiselle. Akuuteilla sepelvaltimotautipotilailla oli puolestaan vain yksi hauras plakki muutoin terveissä sepelvaltimoissa ja heidän maksasoluissaan ei pystytty osoittamaan poikkeavaa miRNA-profiilia. Tämä viittaa siihen, että maksan miRNA:t eivät vaikuta plakin repeämisalttiuteen

hiPSC-derived hepatocytes closely mimic the lipid profile of primary hepatocytes: A future personalised cell model for studying the lipid metabolism of the liver

Peer reviewe

Characterization of long QT syndrome-specific cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells

Pitkä QT-oireyhtymä, (engl. Long QT syndrome, LQTS) on periytyvä tai hankinnainen sydänsairaus, joka ilmenee pidentyneenä repolarisaatiovaiheena sydämessä ja voi johtaa hengenvaaralliseen kääntyvien kärkien takykardiaan (engl. torsades de pointes). Oireyhtymä voidaan todeta sydänsähkökäyrästä pidentyneen QT-ajan perusteella. Sadat eri mutaatiot 15:ssa geenissä (LQT1-15) voivat johtaa periytyvään pitkä QT-oireyhtymään. Maailmalla näiden mutaatioiden esiintyvyys on 1:2000-1:5000. Suomessa kuitenkin jo pelkästään neljän valtamutaation esiintyvyys on 1:250, muiden mutaatioiden lisäksi. Hankinnaisen pitkä QToireyhtymän syynä on usein jokin lääkeaine ja tämä on myös yleisin syy lääkkeiden vetämiseen pois markkinoilta. Pitkä QT-oireyhtymän mutaatioiden kantajat ovat herkempiä hankinnaiselle QT-oireyhtymälle kuin muu väestö, ja siksi pitkä QT-oireyhtymälle ominaiset sydänsolut voisivat toimia perusteellisena mallina sydämelle haitallisten aineiden tutkimista varten. Lisäksi pitkä QToireyhtymälle ominaiset sydänsolut soveltuisivat oireyhtymän tutkimiseen ja uusien lääkkeiden kehittämiseen. Tämä tutkielma oli osa laajempaa projektia, joka keskittyi pitkä QT-oireyhtymälle ominaisten sydänsolujen validointiin, joita voisi sen jälkeen käyttää yllä mainittuihin tarkoituksiin. iPS-soluteknologia mahdollistaa eri taudeille ominaisten erittäin monikykyisten kantasolujen tuottamisen, jotka voivat erilaistua miksi tahansa solutyypiksi. Tässä tutkielmassa käytin kahta LQT2:lle ominaista iPS solulinjaa, jotka olivat peräisin 44-vuotiaalta naispotilaalta. Nainen on heterotsygootti suomalaisen valtamutaation L552 suhteen, KCNH2-geenissä, joka koodaa sydämessä esiintyvän nopeasti aktivoituvan kaliumkanavan α-alayksikköä. iPS-solujen todettiin aluksi ilmentävän erittäin monikykyisille soluille tyypillisiä merkkigeenejä ja erilaistuvan alkionkaltaisiksi solurykelmiksi, jotka sisälsivät kaikkien alkiokerrosten soluja. Tämän jälkeen erilaistin iPS-solut sydänsoluiksi viljelemällä niitä yhdessä END-2-solujen kanssa. Tutkin sydänsolujen sykkeen mekaanisia ominaisuuksia videonauhoitusten avulla. LQT2:lle ominaisilla soluilla oli pitkä QT-oireyhtymästä johtuva fenotyyppi soluviljelmässä: 43 % yksittäisistä LQT2:lle ominaisista sydänsoluista sykkivät epätavallisesti ja ne pysyivät supistuneena kauemmin kuin tavallisesti sykkivät solut. Tämä fenotyyppi oli paljon lievempi LQT2:lle ominaisilla sydänsolurykelmillä. Lopuksi tutkin KCNH2:n villityypin ja mutatoituneen alleelin ilmentymissuhteita kyseisen naispotilaan sydänsolujen ja hänen poikansa sydänsolujen välillä. Pojalla on sama mutaatio kuin äidillään, mutta hänellä ei ole kliinisiä oireita. Sydänsolut molemmilta yksilöiltä ilmensivät KCNH2-alleeleja suhteessa 1:2 - 1:1 (villityyppi:mutaatio). Tämän perusteella epätasapaino eri alleelien ilmentymisessä ei selitä kliinisten fenotyyppien eroja. Kaiken kaikkiaan tämän tutkielman tulokset viittaavat siihen, että tutkielmassa käytettyjä solulinjoja voidaan tulevaisuudessa käyttää tautimallina, sydämelle haitallisten aineiden seulontaan ja uusien hoitomuotojen löytämiseen LQT2-potilaille sen jälkeen kun solulinjojen validointi on valmis.Long QT syndrome, LQTS, is a congenital or acquired cardiac disorder characterized by prolonged cardiac repolarization phase. It is observed as a prolonged QT period in electrocardiodiagraph and can cause life-threatening specific ventricular tachycardia, torsades de pointes. Hundreds of mutations in 15 genes (LQT1-15) are linked to congenital LQTS. Worldwide prevalence of congenital LQTS gene mutations is from 1:2000 to 1:5000. However, the prevalence in Finland is much higher due to four founder mutations that alone occur in one out of 250 individuals. Acquired LQTS is often drug-induced and the most common cause for the withdrawal of drugs on the market. Carriers of LQTS mutations are more susceptible to acquired LQTS than normal population. LQTS-specific cardiomyocytes can thus provide a thorough model for drug cardiotoxicity screening, better insight into disease mechanisms and assist in drug development. This thesis was a part of a bigger project concentrating on validation of LQT2-specific cell lines that could be used for the purposes mentioned above. Induced pluripotent stem (iPS) cell technology enables creation of disease-specific pluripotent stem cell lines, which can be differentiated into any cell type. In this thesis, two LQT2-specific iPS cell lines derived from a clinically symptomatic 44-year-old female were used. She is heterozygous for Finnish founder mutation L552 in KCNH2 gene, which encodes the α-subunit of the cardiac rapidly activating potassium rectifier channel. iPS cells were first verified to express pluripotency markers and to form embryoid bodies containing all germ layers. iPS cells were then differentiated into cardiomyocytes by culturing them with END-2 cells and mechanical beating of the cardiomyocytes was assessed from video recordings. Single LQT2-specific cardiomyocytes showed LQT2-related phenotype in vitro with 43% of single LQT2 cardiomyocytes showing abnormal beating patterns and prolonged contraction time. This phenotype was rescued in LQT2-specific cardiomyocyte clusters. Finally, the expression ratios of wild type and mutated KCNH2 alleles were compared between cardiomyocytes derived from the female and her son, a carrier of the same mutation but with asymptomatic phenotype. Cardiomyocytes from both individuals expressed KCNH2 alleles with the ratio between 1:2 and 1:1 (wt:mut), thus allelic imbalance does not explain differences in the clinical phenotypes. All in all, the results of this thesis suggest that after further validation, mainly electrophysiology studies, these cell lines are most likely suitable to be applied for disease modeling, cardiotoxicity screening and finding new therapies for LQT2

Coronary artery disease patient-derived iPSC-hepatocytes have distinct miRNA profile that may alter lipid metabolism

Abstract Metabolic dysfunction, partly driven by altered liver function, predisposes to coronary artery disease (CAD), but the role of liver in vulnerable atherosclerotic plaque development remains unclear. Here we produced hepatocyte-like cells (HLCs) from 27 induced pluripotent stem cell (iPSC) lines derived from 15 study subjects with stable CAD (n = 5), acute CAD (n = 5) or healthy controls (n = 5). We performed a miRNA microarray screening throughout the differentiation, as well as compared iPSC-HLCs miRNA profiles of the patient groups to identify miRNAs involved in the development of CAD. MicroRNA profile changed during differentiation and started to resemble that of the primary human hepatocytes. In the microarray, 35 and 87 miRNAs were statistically significantly deregulated in the acute and stable CAD patients, respectively, compared to controls. Down-regulation of miR-149-5p, -92a-3p and -221-3p, and up-regulation of miR-122-5p was verified in the stable CAD patients when compared to other groups. The predicted targets of deregulated miRNAs were enriched in pathways connected to insulin signalling, inflammation and lipid metabolism. The iPSC-HLCs derived from stable CAD patients with extensive lesions had a distinct genetic miRNA profile possibly linked to metabolic dysfunction, potentially explaining the susceptibility to developing CAD. The iPSC-HLCs from acute CAD patients with only the acute rupture in otherwise healthy coronaries did not present a distinct miRNA profile, suggesting that hepatic miRNAs do not explain susceptibility to plaque rupture

hiPSC-Derived Cardiomyocyte Model of LQT2 Syndrome Derived from Asymptomatic and Symptomatic Mutation Carriers Reproduces Clinical Differences in Aggregates but Not in Single Cells

Mutations in the HERG gene encoding the potassium ion channel HERG, represent one of the most frequent causes of long QT syndrome type-2 (LQT2). The same genetic mutation frequently presents different clinical phenotypes in the family. Our study aimed to model LQT2 and study functional differences between the mutation carriers of variable clinical phenotypes. We derived human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CM) from asymptomatic and symptomatic HERG mutation carriers from the same family. When comparing asymptomatic and symptomatic single LQT2 hiPSC-CMs, results from allelic imbalance, potassium current density, and arrhythmicity on adrenaline exposure were similar, but a difference in Ca2+ transients was observed. The major differences were, however, observed at aggregate level with increased susceptibility to arrhythmias on exposure to adrenaline or potassium channel blockers on CM aggregates derived from the symptomatic individual. The effect of this mutation was modeled in-silico which indicated the reactivation of an inward calcium current as one of the main causes of arrhythmia. Our in-vitro hiPSC-CM model recapitulated major phenotype characteristics observed in LQT2 mutation carriers and strong phenotype differences between LQT2 asymptomatic vs. symptomatic were revealed at CM-aggregate level.publishedVersionPeer reviewe