Vektorisierte peptidische Inhibitoren zum Erhalt des F508del-CFTR bei Cystischer Fribrose

Cystic fibrosis (CF) is a life-shortening multisystem disease with an incidence of around 1:3,000 individuals. CF is an autosomal recessive genetic disorder which affects the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) chloride ion channel expressed in epithelial cells. More than 1,900 different mutations are known in the CFTR gene, whereby the most common is a deletion of a phenylalanine residue at position 508 of the protein (F508del). These primary defects in epithelial ion transport affect many tissues such as the lungs and the pancreas. Symptomatic treatments are beneficial but impose a large compliance burden, and life expectancy remains under 40 years. Thus, there is a critical unmet need to correct the underlying molecular defect: loss of function in the CFTR. A breakthrough in the molecular treatment of CF was recently shown in a phase 2 trial. Combined administration of VX-809 as “corrector” that acts as a chemical chaperone to assist F508del-CFTR folding and Kalydeco (VX-770) as “potentiator” that enhances CFTR activity showed an improvement of lung function (FEV1) by >10 % for 25 % of patients homozygous for F508del. Success was all the more impressive, because the drugs were designed to address only two of the three molecular defects of F508del-CFTR (inefficient folding and impaired channel gating). In fact, no agent specifically addresses the third defect: rapid degradation of rescued F508del- CFTR. Thus, our hypothesis is that therapeutic targeting of the degradation of mature protein will significantly enhance current combination therapies to rescue F508del-CFTR. In this context, we have validated the CFTR-associated ligand (CAL) as key mediator of CFTR degradation and thus have developed specific peptide inhibitors of CAL (iCAL), as first “stabilizer” compounds that extend CFTR apical half-life and increase chloride channel activity in CF bronchial epithelial cells, both alone and additively in combination with a “corrector”. In the present work, we will characterize different carriers such as cell penetrating peptides (CPPs) or a fatty acid (myristic acid, Myr) covalently coupled to iCAL36/42 and we will evaluated their potential activity as “stabilizer”. First of all, we clearly demonstrated that the coupling of a carrier (CPP or Myr) increase significantly the uptake of iCAL peptides in Caco-2 cells as revealed by spectroscopic fluorescence measurements from cell lysis or by confocal microscopy. However, Myr-iCAL conjugates enter the cells in delayed manner compared to the CPP-iCAL because they stayed trapped in the cell membrane during the first hour of incubation. After a longer period (≈ 3 hours), all used molecules are internalized in the cytosol of Caco-2 cells. Viability experiments on polarized Caco-2 cells revealed no significant cytotoxic effect of all compounds even at 100 μM. Internalization experiments at 4°C or under ATP-depletion revealed that the CPP-iCAL conjugates enter the cells by direct translocation (energy-independent) whereas the uptake of Myr- iCAL compounds at 4°C is reduced (temperature-dependent) probably due to the composition of the membrane. Affinity measurements by fluorescence polarization (FP) indicated that the N-terminal prolongation (by the CPP or Myr) showed a 10 – 20-fold increase in affinity, which could of great interest for the pharmacological development of our compounds. More importantly and for the first time, we can clearly show a specific co-localization of MPG-iCAL36 with overexpressed full-length CAL protein in cellulo, a phenomenon which is not seen with the scrambled sequence (MPG-SC). To assess the potential of our vectorized iCAL peptides to act as “stabilizer”, we measured the change in chloride secretion through the CFTR using Ussing chamber experiments. First attempts done on polarized cells (Caco-2 and HT29/B6 cells) with MPG-iCAL36 pointed incomprehensible problems concerning a drastic decrease of epithelial resistance without a direct effect on cell viability. To obtain suitable epithelial resistance values the Ussing experiments were performed at low MPG- iCAL36 concentration (5 μM), however, at this concentration no increase in chloride secretion could be determined. In a more physiological context, we have also analyzed the internalization, the cytotoxic effect and the ‘stabilizing’ activity of MPG-iCAL36 in human rectal epithelial biopsies from CF-patients. For the first time, we were able to show an increase in Cl- efflux from the biopsy samples after the MPG-iCAL36 incubation (Ussing chamber experiments). More importantly, co-incubation of MPG-iCAL36 and VX-809 revealed an additional increase in Cl- efflux showing a synergistic effect of both molecules. Finally, we looked on protease stability of all our used compounds which is an important requirement in the development of therapeutics. CPP-iCAL compounds are degraded within the first two hours, whereas Myr-iCAL compounds are more stable (>24 hours). Altogether, the presented results are very encouraging concerning the development of CPP- or Myr-based iCAL inhibitors. Tri-therapeutic approach combining a “corrector”, a “potentiator”, and a “stabilizer” should open up promising future treatments to attenuate CF symptoms and to increase life expectancy of CF-patients.Cystische Fibrose ist eine lebensverkürzende Multisystemerkrankung mit einer Häufigkeit von 1:3.000 Individuen. CF ist eine autosomal rezessiv vererbte Erkrankung, welche den Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) betrifft, der von Epithelzellen exprimiert wird. Es sind mehr als 1.900 unterschiedliche Mutationen im CFTR Gen bekannt, wobei die häufigste eine Deletion des Phenylalaninrestes in Position 508 des Proteins (F508del) darstellt. Diese primären Defekte des epithelialen Ionentransportes betreffen viele Gewebe, wie z.B. die Lunge und das Pankreas. Symptomatische Behandlungen sind erfolgreich, aber erschweren die Compliance und die Lebenserwartung bleibt unter 40 Jahren. Daher gibt es einen dringenden bisher nicht umgesetzten Bedarf, den zugrundeliegenden molekularen Defekt zu beheben: nämlich den Funktionsverlust des CFTR selbst. Einen Durchbruch in der molekularen Behandlung von CF wurde kürzlich in einem Phase 2 Zulassungsverfahren gezeigt. Die kombinierte Verabreichung von VX-809, einem „Corrector“ der als ein chemisches Chaperon zur Unterstützung der Faltung des F508del-CFTRs fungiert und Kalydeco (VX-770) als „Potentiator“ der die CFTR Aktivität erhöht, zeigte eine Verbesserung der Lungenfunktion (FEV1) um 10 % von 25 % der Patienten, die homozygot für die F508del Mutation sind. Der Erfolg war umso beachtlicher, weil diese Medikamente nur auf zwei der drei molekularen Defekte abzielten (ineffiziente Faltung und eine gestörte Leitung des Ionenkanals). Tatsächlich ist es so, dass kein Wirkstoff den dritten Defekt adressiert: den schnellen Abbau von verbliebenem F508del-CFTR. Darauf bezugnehmend ist unserer Hypothese, dass ein Therapeutikum, das den Abbau von ausgereiftem Protein beeinflusst, aktuelle Kombinationstherapien zum Erhalt von F508del-CFTR signifikant verbessern könnte. In diesem Zusammenhang haben wir den CFTR assoziierten Liganden (CAL) als Schlüsselmediator des CFTR Abbaus ermittelt und daraus folgend einen spezifischen Peptidinhibitor von CAL (iCAL) entwickelt, der als erster „Stabilisator“ die apikale CFTR Halbwertszeit verlängert und die Chloridionenkanal-Aktivität in bronchialen CF Epithelzellen erhöht, beides allein und additiv in Kombination mit einem „Corrector“. In der hier vorliegenden Arbeit, werden wir unterschiedliche Transporter wie zellpenetrierende Peptide (CPP) oder eine Fettsäure (Myristinsäure) kovalent an iCAL36/42 koppeln und ihre mögliche Aktivität als „Stabilizer“ evaluieren. Nach einer längeren Zeiteinheit (≈ 3 hours) sind alle Moleküle in das Zytosol von Caco-2 Zellen internalisiert. Viabilitätsexperimente zeigten keinen signifikanten zytotoxischen Effekt bei polarisierten Caco-2 Zellen nach Inkubation mit allen Komponenten sogar bei einer Konzentration von 100 μM. Internalisierungsexperimente bei 4°C oder unter ATP-Depletion machten deutlich, dass die CPP-iCAL Konjugate in die Zellen durch direkte Translokation eindringen (energieunabhängig), während die Aufnahme der Myr- iCAL Komponenten unter 4°C (temperaturabhängig) wahrscheinlich durch die Beschaffenheit der Membranen reduziert ist. Affinitätsmessungen durch Fluoreszenzpolarisation zeigen, dass eine N-terminale Verlängerung (durch ein CPP oder Myristinsäure) eine 10-20 fache Erhöhung der Affinität zur Folge hat, was von größtem Interesse für die pharmakologische Entwicklung unserer Komponenten sein könnte. Zum ersten Mal, konnten wir eine klare Kolokalisation von MPG-iCAL36 mit einem überexprimierten CAL protein in cellulo zeigen, ein Phänomen das mit der veränderten iCAL Sequenz (MPG-SC) nicht zu sehen war. Um das Potential als “Stabilisator” unseres vektorisierten iCAL Peptides zu beurteilen, bestimmten wir mit Ussing Kammer Experimenten die Änderung der Cl- Sekretion durch den CFTR. Erste Versuche mit polarisierten Zellen (Caco-2 und HT29/B6 Zellen) und MPG-iCAL36 zeigten jedoch unklare Probleme, die den drastischen Abfall des epithelialen Widerstandes ohne direkten Einfluss auf die Zellviabilität betrafen. Um verwendbare epitheliale Widerstandswerte zu erhalten, mussten wir die Ussing Experimente mit einer niedrigen MPG-iCAL36 Konzentration (5 μM) durchführen und konnten letztlich keinen Anstieg der Cl- Sekretion verzeichnen. Für einen physiologischeren Kontext haben wir mit humanen epithelialen Rektumsbiopsien ebenfalls die Internalisierung, die Zytotoxizität und die Stabilisierungsaktivität von MPG-iCAL36 analysiert. Zum ersten Mal waren wir in der Lage einen Anstieg des Cl- Ausstromes bei Biopsieproben nach MPG-iCAL36 Inkubation (Ussing Kammer Experimente) zu zeigen. Noch wichtiger dabei war, dass die Inkubation von MPG-iCAL36 und VX-809 zusammen einen zusätzlichen Anstieg des Cl- Transportes zur Folge hatte, was einen synergistischen Effekt zeigt. Zum Schluss untersuchten wir die Proteasestabilität aller unserer benutzten Komponenten, was eine wichtige Voraussetzung in der Entwicklung von Medikamenten ist. Die CPP-iCALs wurden während der ersten 24 hours komplett abgebaut, wohingegen die Myr-iCALs stabiler waren (>24 hours). Insgesamt sind die hier präsentierten Ergebnisse sehr ermunternd bezüglich der Entwicklung von CPP- oder Myr- basierten iCAL Inhibitoren. Ein dreitherapeutischer Ansatz der einen „Corrector“, einen „Potentiator“ und einen ‘Stabilisator’ verbindet, könnte eine vielversprechende Zukunft der Behandlung eröffnen, die dann die CF Symptome abmildert und die Lebenserwartung von CF Patienten erhöht

Clinical Significance of Tumor-Infiltrating Conventional and Plasmacytoid Dendritic Cells in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Dendritic cells (DCs) play a key role in the orchestration of antitumor immunity. Activated DCs efficiently enhance antitumor effects mediated by natural killer cells and T lymphocytes. Conversely, tolerogenic DCs essentially contribute to an immunosuppressive tumor microenvironment. Thus, DCs can profoundly influence tumor progression and clinical outcome of tumor patients. To gain novel insights into the role of human DCs in pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), we explored the frequency, spatial organization, and clinical significance of conventional DCs type 1 (cDC1s) and type 2 (cDC2s) and plasmacytoid DCs (pDCs) in primary PDAC tissues. A higher density of whole tumor area (WTA)- and tumor stroma (TS)-infiltrating cDC1s was significantly associated with better disease-free survival (DFS). In addition, an increased frequency of intraepithelial tumor-infiltrating cDC2s was linked to better DFS and overall survival (OS). Furthermore, an increased density of WTA- and TS-infiltrating pDCs tended to improve DFS. Moreover, a higher frequency of WTA- and TS-infiltrating cDC1s and pDCs emerged as an independent prognostic factor for better DFS and OS. These findings indicate that tumor-infiltrating DCs can significantly influence the clinical outcome of PDAC patients and may contribute to the design of novel treatment options that target PDAC-infiltrating DCs

CtpB Assembles a Gated Protease Tunnel Regulating Cell-Cell Signaling during Spore Formation in Bacillus subtilis

Spore formation in Bacillus subtilis relies on a regulated intramembrane proteolysis (RIP) pathway that synchronizes mother-cell and forespore development. To address the molecular basis of this SpoIV transmembrane signaling, we carried out a structure-function analysis of the activating protease CtpB. Crystal structures reflecting distinct functional states show that CtpB constitutes a ring-like protein scaffold penetrated by two narrow tunnels. Access to the proteolytic sites sequestered within these tunnels is controlled by PDZ domains that rearrange upon substrate binding. Accordingly, CtpB resembles a minimal version of a self-compartmentalizing protease regulated by a unique allosteric mechanism. Moreover, biochemical analysis of the PDZ-gated channel combined with sporulation assays reveal that activation of the SpoIV RIP pathway is induced by the concerted activity of CtpB and a second signaling protease, SpoIVB. This proteolytic mechanism is of broad relevance for cell-cell communication, illustrating how distinct signaling pathways can be integrated into a single RIP module