6 research outputs found
Nanotechnology approaches in the current therapy of skin cancer
Skin cancer is a high burden disease with a high impact on global health. Conventional therapies have several drawbacks; thus, the development of effective therapies is required. In this context, nanotechnology approaches are an attractive strategy for cancer therapy because they enable the efficient delivery of drugs and other bioactive molecules to target tissues with low toxic effects. In this review, nanotechnological tools for skin cancer will be summarized and discussed. First, pathology and conventional therapies will be presented, followed by the challenges of skin cancer therapy. Then, the main features of developing efficient nanosystems will be discussed, and next, the most commonly used nanoparticles (NPs) described in the literature for skin cancer therapy will be presented. Subsequently, the use of NPs to deliver chemotherapeutics, immune and vaccine molecules and nucleic acids will be reviewed and discussed as will the combination of physical methods and NPs. Finally, multifunctional delivery systems to codeliver anticancer therapeutic agents containing or not surface functionalization will be summarized
Production of Lentiviral Vectors Encoding Recombinant Factor VIII Expression in Serum-Free Suspension Cultures
Strategies for the production of recombinant factor VIII (FVIIIr) in a human cell line cultured under serum-free suspension conditions
A hemofilia A é uma doença ligada ao cromossomo X causada pela deficiência do fator VIII da coagulação sanguínea (FVIII). O tratamento disponível consiste na terapia de reposição da proteína do fator VIII derivada do plasma (FVIIIdp) ou recombinante (FVIIIr). Atualmente, dos 7 produtos recombinantes disponíveis no mercado, 6 são produzidos em linhagens celulares de roedores. A expressão dessa proteína em sistemas celulares não-humanos pode gerar uma molécula com perfil de modificações diferente do endógeno, podendo levar a reações imunogênicas e geração de inibidores anti-FVIIIr. Em função disso, novas estratégias de produção têm sido avaliadas, como a utilização de células hospedeiras mais eficientes no que diz respeito ao potencial de expressão da proteína de interesse. Dentre as linhagens de interesse, a linhagem hepática SK-HEP-1 tem se destacado por apresentar altos níveis de expressão do FVIIIr e potencial para o cultivo em suspensão em meios livres de soro fetal bovino (SFB). Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de FVIIIr na linhagem celular humana SK-Hep-1 comparando duas estratégias para o estabelecimento de processos de produção em condições livres de soro e em suspensão: Estratégia 1 - adaptação para tais condições da linhagem já modificada geneticamente e Estratégia 2 - modificação gênica para a expressão da proteína já em células previamente adaptadas à tais condições. Para a estratégia 1, foram geradas duas linhagens recombinantes produtoras de FVIIIr, SK-HEP-F8/Neo-E1 e SK-HEP-F8/GFP-E1 aderentes e em cultivos suplementados com SFB. Na caracterização da cinética e produção do FVIIIr as linhagens apresentaram taxas específicas máxima de crescimento (?max) de 0,064 e 0,0031h-1 produzindo 1,0 e 0,78UI/mL de FVIIIr, respectivamente. Diversos protocolos de adaptação foram empregados, entretanto, não foi possível obter sucesso na adaptação das linhagens recombinantes para condições livres de soro e em suspensão. Para a estratégia 2, as células SK-HEP-1 selvagens adaptadas ao meio de cultura livre de SFB SFMII apresentaram um valor de ?max de 0,0186h-1 e Xmax de 1,9x106cels/mL. Para as etapas de modificação gênica da linhagem selvagem foram utilizados os mesmos vetores lentivirais empregados para a geração das células recombinantes aderentes, pLVmpsvFVIII?B-Neo e pLVCMVFVIII?B-GFP. Para o primeiro, não foi possível gerar uma linhagem produtora do FVIIIr. Para o segundo, foi possível obter duas linhagens produtoras do FVIIIr com 0.14 e 0.12IU/mL de atividade pelo ensaio cromogênico. O presente trabalho mostrou que a linhagem humana Sk-Hep-1 é apropriada para a produção de altos níveis de FVIIIr. No entanto, maiores esforços devem ser voltados ao desenvolvimento de meios de cultura livres de soro específicos para a linhagem para possibilitar a produção eficiente do FVIIIr em suspensão em meios livre de soro.Hemophilia A is a genetic X-linked disorder caused by the coagulation factor VIII (FVIII) deficiency. The current treatment is the replacement therapy with plasma derived FVIII (pdFVIII) or recombinant FVIII (rFVIII) products. Nowadays, of the seven products available in the market, six are produced in rodent expression systems, which can result in a rFVIII molecule with different post-translational modifications and may lead to immune responses to non-human epitopes. Therefore, new production strategies have been evaluated, as the use of more efficient hosts in terms of protein expression potential. Among potential cell lines, the hepatic SK-HEP-1 cell line features high levels of rFVIII production and potential for serum-free suspension culture. In face of the exposed above, the goal of this study was to evaluate rFVIII production in the SK-HEP-1 human cell line comparing two strategies for the establishment of production process in a suspension serum-free condition: strategy 1 - adaptation to these conditions of a genetic modified cell line; strategy 2 - genetic modification of an already adapted cell line to rFVIII protein expression. For strategy 1, two adherent rFVIII producer cell lines were established in serum containing medium, SK-HEP-F8/Neo-E1 e SK-HEP-F8/GFP-E1. Characterization of cell growth and rFVIII production showed a maximum specific growth rate (?max) of 0.064 and 0.00311h-1 with rFVIII production of 1.0 and 0.78UI/mL, respectively. Different adaptation protocols were used; however, it was not possible to adapt the recombinant cell lines to growth in suspension serum-free conditions. For strategy 2, the wildtype SK-HEP-1 cell line adapted growth in SFMII BSF medium, showed a ?max of 0.0186h-1 and a maximum cell concentration (Xmax) of 1.9x106cells/mL. For the genetic modification, it were employed the same lentiviral vectors used for the recombinant adherent cells generation, pLVmpsvFVIII?B-Neo and pLVCMVFVIII?B-GFP. For the first, no attempts were successful. For the second, it was possible to generate two rFVIII producer populations with 0.14 and 0.12IU/mL activity, measured by chromogenic assay. These results demonstrate that the SK-HEP-1 cell line is appropriate for the production of high levels of rFVIII. Nevertheless, efforts should be made in developing specific medium to support efficient rFVIII production in suspension and suspension serum-free conditions
Development of a liposomal system for delivery of the acid alphaglucosidase as a proposition for therapy of the Pompe disease
A doença de Pompe é causado pela deficiência da enzima lisossomal α-glicosidase ácida (GAA) resultando em acúmulo de glicogênio nas células. Os principais tecidos atingidos são o cardíaco, os musculares e o nervoso. O espectro clínico compreende uma forma infantil, mais severa com alta morbilidade e mortalidade, e uma tardia, com progressão mais lenta, que resulta em fraqueza muscular e insuficiência respiratória. A terapia atualmente disponível consiste na reposição enzimática com uma enzima recombinante e representou uma melhora significativa da expectativa de vida dos pacientes. Apesar disso, alguns fatores ainda limitam seus benefícios, como a baixa biodisponibilidade e absorção da enzima livre pelas células alvo, não interrompendo a progressão da doença. Dessa forma, o uso da nanotecnologia no desenvolvimento de sistemas de liberação de fármacos surge como uma alternativa para superar as dificuldades da aplicação da enzima livre na circulação sanguínea. Entre os sistemas disponíveis, os lipossomas representam uma tecnologia avançada de carreamento de moléculas ativas. Os lipossomas são estruturas vesiculares fosfolipídicas biocompatíveis e biodegradáveis que permitem a entrega de agentes terapêuticos para o interior das células ou compartimentos celulares. O revestimento da superfície lipossomal com componentes hidrofílicos, como o polietilenoglicol (PEG), aumenta significativamente seu tempo de circulação. Ainda, ligantes específicos, como anticorpos, têm sido incorporados na superfície desses lipossomas buscando o direcionamento ativo para um local alvo. Com isso, o uso de um carreador lipossomal de longa circulação e funcionalizado com o anticorpo para o receptor de insulina humana representa uma proposta inovadora para otimizar a distribuição da enzima da GAA para os tecidos alvos, diminuindo a dose terapêutica necessária e superando as atuais barreiras para um tratamento adequado da doença de Pompe. No presente trabalho, foram padronizadas condições experimentais para obtenção de lipossomas peguilados contendo a enzima GAA. Os sistemas obtidos apresentaram tamanho em torno de 135 nm com uma polidispersividade de 0,144, potencial zeta de -25,2 mV e eficiência de encapsulamento de 90% para a GAA. Os ensaios de atividade enzimática demonstraram a estabilidade da enzima durante o processo de obtenção dos lipossomas. A funcionalização da superfície dos sistemas com anticorpo para o receptor de insulina apresentou eficiência de 90%. Com isso, demonstramos que a GAA pode ser encapsulada em um sistema lipossomal peguilado, com tamanho e distribuição de tamanho adequadas para aplicação endovenosa. Os ensaios de citometria de fluxo e microscopia confocal demonstraram que as formulações funcionalizadas são capazes de adentrar a célula e entregar a enzima no interior dos lisossomos com maior eficiência. Dessa forma, a futura aplicação de lipossomas direcionados para o receptor de insulina apresenta perspectivas de diminuição da dose terapêutica da GAA e a superação de importantes barreiras biológicas para o tratamento adequado da doença de Pompe.Pompe disease is a rare autosomal recessive lysosomal storage disease caused by deficiency of the enzyme acid-alfa-glucosidase (GAA), resulting in glycogen accumulation in the lysosomes of cardiac muscle, skeletal muscle, and motor neurons, which ultimately results in cardiorespiratory failure. The only therapy clinically available is the enzyme replacement therapy (ERT). However, the low availability and poor uptake of the recombinant enzyme by the target cells still limits the benefits of the treatment. In this scenario the development of drug carrier systems emerges as an alternative to overcome these problems. Liposomes coated with hydrophilic polymer, such as PEG (polyethylene glycol) represents an advanced technology to deliver therapeutic agents to a target site. In the present study we developed a liposomal formulation encapsulating the GAA enzyme and functionalized with the anti-insulin receptor. Liposomes composed of DPSC, Cholesterol, DSPE-PEG and DSPE-PEGmaleimide were prepared by thin-film hydration method followed by extrusion in 100 nm polycarbonate membranes. The best parameters of lipid concentration, velocity of rotation of the flask in the evaporation and hydration phase and number of extrusion cycles were determined by a Box-Behnken design. Liposomes were characterized for size, polydispersity (PDI), zeta potential, stability, concentration and efficiency of the encapsulation of the GAA. Also, the enzyme had its activity assessed during all stages of liposome production. After preparing 15 different formulations of liposomes, we were able to establish the best parameters of liposome production. The resulting formulation showed a medium size of 135.2nm, a PDI of 0.144 and zeta potential of -25.2mV. There was no difference in size and PDI when encapsulating the enzyme. Also, we accessed the levels of activity of the enzyme during hydration and extrusion and there was no loss of activity when compared to optimal conditions. The formulations were found to be stable for at least a month when stored at 4°C and 37°C. The efficiency of encapsulation of the GAA was indirectly and directly measured by Bradford protein assay and showed an efficiency of around 90% by both methods. We demonstrated by flow cytometry that the liposomes were efficiently internalized by endothelial cells and that the pre-treatment with insulin significantly reduce uptake of anti-insulin receptor coated liposomes. Moreover, confocal microscopy image analysis demonstrated that anti-insulin receptor coated liposomes have a higher colocalization with a specific lysosomal marker when compared to plain liposomes. The use of nanotechnology is an interesting strategy to overcome the barriers of a successful ERT for lysosomal storage disorders. Here, we presented a stable pegylated liposome with characteristics suitable for an intravenous application. The efficient encapsulation of the GAA enzyme demonstrate the possible application of a liposomal system in the pursuit of an adequate treatment of Pompe disease
Production of Lentiviral Vectors Encoding Recombinant Factor VIII Expression in Serum-Free Suspension Cultures
ABSTRACT Lentiviral vector-mediated gene transfer offers several advantages over other gene delivery vectors when considering gene and cell therapy applications. However, using these therapies in clinical applications involves large-scale vector production in an efficient and cost-effective manner. Here we describe a high yield production of a lentivirus encoding recombinant factor VIII in a scalable and GMP-compliant culture system, based on serum free suspension cultures and transient transfection with an inexpensive reagent, polyethylenimine (PEI), reaching a total viral yield of 2.48x108 particles