Force spectroscopy and single molecule detection with optical tweezers

Sischka A. Kraftspektroskopie und Einzelmoleküldetektion mit der Optischen Pinzette. Bielefeld (Germany): Bielefeld University; 2005.A compact, single beam optical tweezers system for force measurements and manipulation of individual double-stranded DNA (dsDNA) molecules was integrated into a commercial inverted optical microscope. A maximal force of 350 pN combined with a force sensitivity of less than 0.5 pN allows measurements of elastic properties of single molecules which complements and overlaps the force regime accessible with atomic force microscopy (AFM). The manipulation and measurement performance of this system was tested with individual Lambda DNA molecules and renders new aspects of dynamic forces phenomena with higher precision in contrast to AFM studies. An integrated liquid handling system with a fluid cell allows investigation of the force response of individual DNA molecules in the presence of DNA binding agents. Mechanical properties of double-stranded DNA (dsDNA) in the presence of different binding ligands were analyzed in optical tweezers experiments with sub-piconewton force resolution. Different binding modes could unambiguously be distinguished by analyzing the mechanic response of a dsDNA molecule to an applied external force. We compared the effects of the minor groove binder distamycin-A, a major groove binding alpha-helical peptide, the intercalator ethidium bromide, YO-1 and daunomycin as well as the bisintercalator YOYO-1 on Lambda DNA. Binding of molecules to the minor and major groove to dsDNA induces distinct changes in the molecular elasticity compared to the free dsDNA detectable as a shift of the B-S transition to higher forces. Intercalating molecules affect the molecular mechanics by a complete disappearance of the B-S transition and an associated increase in molecular contour length. Significant force hysteresis effects occurring during stretching/relaxation cycles with velocities in the range between 100 nm/s and 12,000 nm/s were found for daunomycin YOYO-1. These time dependent mechanical properties directly reflect the kinetics of the binding and unbinding. Force dependent time constants of 0.29 - 1.34 s and 0.15 - 0.60 s were determined for YOYO-DNA complexes and daunomycin-DNA complexes, respectively. Also we used the optical tweezer setup as an optiomechanical force transducer to analyze the rupture forces between mouse anti-chicken immunoglobulin class M (Anti-IgM) coupled to the surface of a trapped bead and membrane-bound B-cell receptors (immunoglobulin class M) on living chicken DT40 B-cells. The experiment exhibits specific single and multiple bond interactions and dissociations when an external force was applied. At a loading rate of 45 pN/s a single bond rupture force of 12.5 pN and integer multiples of this value during multiple bond rupturing could be identified. These experiments will allow interesting and important in-vitro testing of living cells in the future.Sowohl die Untersuchung der Elastizität kettenförmiger Polymere, die Charakterisierung der Bindung kleiner Moleküle, wie beispielsweise Peptide und Proteine, an eine DNA als auch Kraftmessungen zwischen Liganden und Rezeptoren in oder auf den verschiedensten biologischen Systemen, unter anderem mit der Zielsetzung, Kinetik, Gleichgewichtszustände, strukturelle Charakteristika oder Details der Energielandschaft der Bindungen zu beschreiben - sie alle verlangen nach äußerst sensitiven Kraftmessmethoden. Die beiden prominentesten Techniken sind hierbei die AFM-Kraftspektroskopie und die Optische Pinzette, die parallel zu ihrer überragenden Kraftauflösung auch weit in den Bereich der höheren Kräfte des AFMs vordringen kann. Das Prinzip der Optischen Pinzette basiert auf einem stark fokussierten Laserstrahl, der es ermöglicht, eine dreidimensionale Optische Falle - oder auch Photonisches Potential - zu generieren. Darin können Objekte der Größe einzelner Atome bis hin zu mehreren Dutzend Mikrometern gefangen werden. Das gezielte Fangen und Bewegen von Objekten mit Hilfe der Optischen Falle stellt nur eine Facette der Möglichkeiten dieses Systems dar. Weitaus verfeinerter sind die Mittel, das gefangene Objekt als einen Sensor für äußere Kräfte in dessen unmittelbarer Umgebung zu benutzen. Hierbei können die Auslenkungen des Objektes - welches bei den meisten biophysikalisch relevanten Untersuchungen ein transparentes Kügelchen ist - in eine Kraft übersetzt werden. Im Gegensatz zum AFM, bei dem für Kraftmessungen biochemisch präparierte Oberflächen benötigt werden, kann sich bei der Optischen Pinzette beispielsweise dem zu untersuchenden Objekt von mehreren Seiten beliebig angenähert werden, da das gefangene Objekt frei im Raum bewegt werden kann. Die gezielte biochemische Präparation des gefangenen Objektes eröffnet außerdem die Möglichkeit, die zu charakterisierenden Systeme, wie Makromoleküle oder Proteine, selektiv zu immobilisieren und diese dann gezielt in Kontakt zu bringen mit weiteren zu untersuchenden Molekülen. In dieser Arbeit werden lokale Viskositätsmessungen in Gegenwart von Grenzflächen durchgeführt. Eine weitere Fragestellung ist die Messung von Kräften an intrazellulären Systemen der Signalweiterleitung sowie das noch relativ unerforschte Gebiet der Kraftspektroskopie der Optischen Pinzette an lebenden Zellen. Vorrangigste Untersuchungsgebiete sind jedoch die mechanischen Eigenschaften von doppelsträngigen DNA-Molekülen (in Abhängigkeit von äußeren Parametern) und die Veränderung der Charakteristika in Abhängigkeit von schwach oder unspezifisch bindenden Liganden. Unterschiedlichste Bindungsmoden konnten identifiziert und differenziert werden und quantitative Aspekte der Elastizität jener Komplexe beschrieben werden. Die bislang nahezu kaum charakterisierte Kinetik der Bindungen jener Liganden an dsDNA stellte ein weiteres Untersuchungsgebiet dar. Dies ermöglichte wiederum Rückschlüsse auf konformative und zeitliche Änderungen der Bindung von Liganden an DNA

Verfahren und Vorrichtung zur Messung der Kraft, die auf ein in einer optischen Fallenanordnung gefangenes Objekt wirkt

Anselmetti D, Sischka A. Verfahren und Vorrichtung zur Messung der Kraft, die auf ein in einer optischen Fallenanordnung gefangenes Objekt wirkt. 2007

Kraftmessung in Rücksteuerung an Optischer Pinzette

Anselmetti D, Sischka A. Kraftmessung in Rücksteuerung an Optischer Pinzette. 2007

Compact microscope-based optical tweezers system for molecular manipulation

Sischka A, Eckel R, Tönsing K, Ros R, Anselmetti D. Compact microscope-based optical tweezers system for molecular manipulation. Review of scientific instruments. 2003;74(11):4827-4831.A compact single beam optical tweezers system for force measurements and manipulation of individual double-stranded deoxyribonucleic acid (DNA) molecules was integrated into a commercial inverted optical microscope. A maximal force of 150 pN combined with a force sensitivity of less than 0.5 pN allows measurements of elastic properties of single molecules which complements and overlaps the force regime accessible with atomic force microscopy (AFM). The manipulation and measurement performance of this system was tested with individual [lambda]-DNA molecules and renders new aspects of dynamic forces phenomena with higher precision in contrast to AFM studies. An integrated liquid handling system with a fluid cell allows investigation of the force response of individual DNA molecules in the presence of DNA binding agents. Comparison of YOYO-1-, ethidium bromide intercalated DNA, and distamycin-A complexed DNA revealed accurate and reproducible differences in the force response to an external load. This opens the possibility to use it as a single molecule biosensor to investigate DNA binding agents and even to identify molecular binding mechanisms

Verfahren zur Stabilisierung eines Laserstrahls (Beam Point Stabilizer)

Anselmetti D, Sischka A, Tönsing K. Verfahren zur Stabilisierung eines Laserstrahls (Beam Point Stabilizer). 2006

Beam Point und Beam Profile Stabilizer

Anselmetti D, Sischka A, Tönsing K. Beam Point und Beam Profile Stabilizer. 2007

Nanomechanics of Fluorescent DNA Dyes on DNA Investigated by Magnetic Tweezers

Wang Y, Sischka A, Walhorn V, Tönsing K, Anselmetti D. Nanomechanics of Fluorescent DNA Dyes on DNA Investigated by Magnetic Tweezers. Biophysical Journal. 2016;111(8):1604-1611.Fluorescent DNA dyes are broadly used in many biotechnological applications for detecting and imaging DNA in cells and gels. Their binding alters the structural and nanomechanical properties of DNA and affects the biological processes that are associated with it. Although interaction modes like intercalation and minor groove binding already have been identified, associated mechanic effects like local elongation, unwinding, and softening of the DNA often remain in question. We used magnetic tweezers to quantitatively investigate the impact of three DNA-binding dyes (YOYO-1, DAPI, and DRAQ5) in a concentration-dependent manner. By extending and overwinding individual, torsionally constrained, nick free dsDNA molecules, we measured the contour lengths and molecular forces that allow estimation of thermodynamic and nanomechanical binding parameters. Whereas for YOYO-1 and DAPI the binding mechanisms could be assigned to bis-intercalation and minor groove binding, respectively, DRAQ5 exhibited both binding modes in a concentration-dependent manner

Nanopore Translocation Dynamics of a Single DNA-Bound Protein

Spiering A, Getfert S, Sischka A, Reimann P, Anselmetti D. Nanopore Translocation Dynamics of a Single DNA-Bound Protein. NANO Letters. 2011;11(7):2978-2982

Binding Kinetics of Bisintercalator Triostin A with Optical Tweezers Force Mechanics

The binding kinetics of the intercalative binding of Triostin A to λ-DNA was investigated by measuring the force extension response of the DNA-ligand complexes with an optical tweezers system. These force response curves, containing the information about different binding properties, were analyzed based on a recent method (put forth by another research group) for monointercalators that was extended to bisintercalators. Our binding analysis reveals an exponential dependence of the association constant on the applied external force as well as a decreasing binding site size. In general, our results are in agreement with those for the monointercalator ethidium. However, to explain the high-force binding site size, a new model for bisintercalation of Triostin A at high forces is proposed

Optical-Tweezers Study of Topoisomerase Inhibition

Pla D, Sischka A, Albericio F, Alvarez M, Fernandez-Busquets X, Anselmetti D. Optical-Tweezers Study of Topoisomerase Inhibition. Small. 2009;5(11):1269-1272