Disseminação de vírus em campos de alho cultivado em diferentes sistemas de produção no Brasil

Amostras de quatro regiões produtoras que representam aproximadamente 76% da área de alho plantada no Brasil, foram testadas por RT-PCR para a presença de Onion yellow dwarf virus (OYDV), Leek yellow stripe virus (LYSV), Garlic common latent virus (GCLV), Garlic virus C (Garv-C), Garlic virus D (Garv-D) e Garlic mite-borne filamentous virus (GarMbFV). As amostras (352 bulbos) foram provenientes de cinco sistemas de cultivo: alho tradicional comum (CG), alho tradicional livre de vírus (VFCG), alho nobre não-vernalizado (NVNGSG) e alho nobre vernalizado cultivado por pequenos produtores (VNGSG), e alho nobre vernalizado utilizado por grandes produtores (VNGMG). Infecções múltiplas foram detectadas em 22% das amostras. As espécies de potyvírus foram observadas em todas as regiões. O LYSV prevaleceu sobre OYDV enquanto o carlavírus, GCLV foi o menos disseminado. Garv-C e GarMbFV foram as mais prevalentes entre os allexivírus. O sistema de produção NVNGSG teve uma maior prevalência de LYSV e Garv-C. O sistema de produção CG apresentou a maior prevalência de todas as espécies, especialmente LYSV (94% das amostras). As regiões com maior nível tecnológico tiveram a menor prevalência viral. As informações deste monitoramento, poderão auxiliar no estabelecimento de estratégias visando o aumento da qualidade fitosanitária e da produtividade nacional do alho.Samples from four regions, representing 76% of the garlic growing area in Brazil, were tested by RT-PCR for the presence of Onion yellow dwarf virus (OYDV), Leek yellow stripe virus (LYSV), Garlic common latent virus (GCLV), Garlic virus C (GarV-C), Garlic virus D (GarV-D) and Garlic mite-borne filamentous virus (GarMbFV). The samples (352 bulbs) represented five agricultural systems: traditional common garlic (CG), virus-free common garlic (VFCG), non-vernalized noble garlic (NVNGSG) and vernalized noble garlic cultivated by small growers (VNGSG), and vernalized noble garlic adopted by major growers (VNGMG). Multiple infections were detected in 22% of the samples. Potyvirus species were present in all regions. LYSV prevailed over OYDV while the carlavirus GCLV was less prevalent. GarV-C and GarMbFV were the most prevalent among the allexivirus species. The NVNG production system had a higher prevalence of LYSV and GarV-C. The CG production system, that uses less technology, had the highest prevalence for all species, especially LYSV that prevailed in 94% of the samples. Overall, the regions with higher technological input employing better quality seeds had the lowest viral prevalence for all species. This monitoring provides information to establish a strategy to raise the phytosanitary quality and the national productivity of garlic

Colonization of garlic plants by Neotoxoptera formosana in Distrito Federal, Brazil

Plantas de alho da cv. Amarante, cultivadas em casa de vegetação para detecção da ocorrência de viroses, foram naturalmente infestadas por afídeos de coloração escura durante a primavera de 2001. Com o objetivo de identificar a espécie em questão foram coletados indivíduos alados, capturados com armadilha constituída por bandeja amarela com água, além de formas ápteras. A identificação da espécie foi feita segundo a chave descritiva elaborada por Blackman & Eastop (1984) e por comparação com espécimes de Neotoxoptera formosana e N. oliveri da coleção do Depto. Fitopatologia da Universidade de Brasília. O afídeo encontrado em alho pertence à espécie Neotoxoptera formosana Takahashi, 1921.Garlic plants (cv. Amarante) cultivated during the spring in the greenhouse for detection of viruses, were found to be naturally colonized by a dark aphid. For species identification, specimens of the few alatae individuals collected by pan yellow water traps and many apterae individuals were compared to the species descriptions in Blackman & Eastop (1984). The specimens were also compared with Neotoxoptera formosana and N. oliveri from the aphid collection of the Phytopathology Department of the University of Brasília. The aphid found in the garlic plants belongs to the species Neotoxoptera formosana Takahashi, 1921

Cultura de ápices caulinares e termoterapia na recuperação de plantas livres de vírus de alho

A cultura de ápices caulinares de alho, associada à termoterapia a seco (exposição dos bulbilhos a temperatura de 37°C, por um período de 35 dias) foi essencial para recuperação de plantas livres de vírus das cultivar de alho Amarante. Nestas condições, 70% dos explantes inoculados se desenvolveram in vitro e produziram plantas, das quais 77% não apresentaram partículas virais quando indexadas por ISEM. Isto resulta em um índice de aproveitamento de 54% dos bulbilhos submetidos à termoterapia. O aumento da temperatura na termoterapia para 40°C reduziu a regeneração in vitro para 20%, e 90% dessas plantas estavam livres de vírus, com um índice final de aproveitamento de 18%.Garlic shoot tip culture associated with dry heat thermotherapy (cloves exposed to 37°C for 35 days) were essential for recovering virus free plants of the cv Amarante. In this condition 70% of the explants developed in vitro and produced plants. A total of 77% of those plants was virus free when indexed by ISEM, which resulted in a final index of 54% of virus free plants from treated cloves. The percentage of regeneration decreased to 20% as the temperature increased up to 40°C. However 90% of those plants were virus free, leading to a final index of 18% virus free plants out of treated cloves

Rhizosphere bacterial communities of potato cultivars evaluated through PCR-DGGE profiles

O objetivo deste trabalho foi determinar as alterações nos perfis de PCR-DGGE das comunidades bacterianas associadas à rizosfera de cultivares de batata, para obter informações para futuros estudos de avaliação de risco ambiental de plantas de batatas geneticamente modificadas. Foi conduzido experimento em casa de vegetação com cinco cultivares de batata (Achat, Bintje, Ágata, Monalisa e Asterix), cultivadas em vasos com solo de um sistema integrado de produção agroecológica. O delineamento experimental foi o de blocos ao acaso, em parcelas subdivididas, com cinco cultivares, três períodos amostrais e cinco repetições. As amostras de rizosfera foram coletadas em três diferentes épocas durante o desenvolvimento das plantas. O DNA dos microrganismos associados à rizosfera foi extraído, amplificado por PCR com uso de iniciadores universais para bactérias e analisados por DGGE. Foram observadas alterações, relacionadas à cultivar e à idade da planta, nos perfis das comunidades bacterianas associadas à rizosfera das diferentes cultivares. As diferenças entre as comunidades bacterianas foram maiores na fase inicial do crescimento das plantas, com tendência a diminuir no estágio final de desenvolvimento. Essa variação foi detectada na comunidade bacteriana das cinco cultivares estudadas. A caracterização da microbiota do solo pode ser parte de programas de melhoramento de plantas a ser utilizada em estudos de avaliação de risco ambiental de batatas geneticamente modificadas.The objective of this work was to determine the shifts on the PCR-DGGE profiles of bacterial communities associated to the rhizosphere of potato cultivars, in order to generate baseline information for further studies of environmental risk assessment of genetically modified potato plants. A greenhouse experiment was carried out with five potato cultivars (Achat, Bintje, Agata, Monalisa and Asterix), cultivated in pots containing soil from an integrated system for agroecological production. The experiment was conducted in a split plot randomized block design with five cultivars, three sampling periods and five replicates. Rhizosphere samples were collected in three sampling dates during plant development. DNA of rhizosphere microorganisms was extracted, amplified by PCR using bacterial universal primers, and analyzed through DGGE. Shifts on the rhizosphere bacterial communities associated to rhizosphere of different cultivars were related to both cultivar and plant age. Differences among rhizosphere bacterial communities were clearest at the earliest plant age, tending to decrease in later stages. This variation was detected among bacterial communities of the five tested cultivars. The characterization of soil microbial communities can be part of plant breeding programs to be used on studies of environmental risk assessment of genetically modified potatoes

A baculovirus-mediated strategy for full-length plant virus coat protein expression and purification

Background: Garlic production is severely affected by virus infection, causing a decrease in productivity and quality. There are no virus-free cultivars and garlic-infecting viruses are difficult to purify, which make specific antibody production very laborious. Since high quality antisera against plant viruses are important tools for serological detection, we have developed a method to express and purify full-length plant virus coat proteins using baculovirus expression system and insects as bioreactors. Results: In this work, we have fused the full-length coat protein (cp) gene from the Garlic Mite-borne Filamentous Virus (GarMbFV) to the 3′-end of the Polyhedrin (polh) gene of the baculovirus Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV). The recombinant baculovirus was amplified in insect cell culture and the virus was used to infect Spodoptera frugiperda larvae. Thus, the recombinant fused protein was easily purified from insect cadavers using sucrose gradient centrifugation and analyzed by Western Blotting. Interestingly, amorphous crystals were produced in the cytoplasm of cells infected with the recombinant virus containing the chimeric-protein gene but not in cells infected with the wild type and recombinant virus containing the hexa histidine tagged Polh. Moreover, the chimeric protein was used to immunize rats and generate antibodies against the target protein. The antiserum produced was able to detect plants infected with GarMbFV, which had been initially confirmed by RT-PCR. Conclusions: The expression of a plant virus full-length coat protein fused to the baculovirus Polyhedrin in recombinant baculovirus-infected insects was shown to produce high amounts of the recombinant protein which was easily purified and efficiently used to generate specific antibodies. Therefore, this strategy can potentially be used for the development of plant virus diagnostic kits for those viruses that are difficult to purify, are present in low titers or are present in mix infection in their plant hosts

Purification of potato leaf roll virus (PLRV) for antiserum production

Um isolado do vírus do enrolamento-da-folha-da-batata (PLRV) foi purificado segundo procedimento envolvendo extração enzimática, clarificação com Triton X - 100, clorofórmio e butariol, precipitação com PEG, centrifugações diferenciais e gradiente congelado de sacarose. A preparação purificada foi submetida a uma centrifugação isopícnica em gradiente de CsCl, estabilizada com formaldeido e injetada em coelho para produção de anti-soro. Este foi avaliado por DAS-ELISA no CNPH/EMBRAPA e por diversas instituições públicas e privadas. Os resultados indicam que o anti-soro produzido é específico e adequado ao uso em sistemas de indexação de batata-semente e para fins de pesquisa. Este trabalho concluiu o programa de produção de anti-soros para diagnose de vírus em batata, do CNPH/EMBRAPA, que também conta com anti-soros para detecção de APMV, PVS, PVX e PVY.An isolate of potato leaf roll virus (PLRV) was purified through enzimatic extraction, Triton X-100 and chloroform:butanol clarification, PEG precipitation, differential centrifugations, freezed and thowed sucrose gradient and a CsCl isopienic centrifugation. The antiserum produced was tested at CNPH/EMBRAPA and at other public and private institutes. The results showed a specific serum suitable for indexing programs as well as research. This concludes the potato viruses antisera production program at CNPH/EMBRAPA which also have antisera for APMV, PVS, PVX and PVY

Detection of three Allexivirus species infecting garlic in Brazil Detecção de três espécies de Allexivirus que infectam o alho no Brasil

Garlic viruses often occur in mixed infections under field conditions. In this study, garlic samples collected in three geographical areas of Brazil were tested by Dot-ELISA for the detection of allexiviruses using monoclonal specific antibodies to detect Garlic virus A (GarV-A), Garlic virus B (GarV-B), Garlic virus C (GarV-C) and a polyclonal antiserum able to detect the three virus species mentioned plus Garlic virus D (GarV-D). The detected viruses were biologically isolated by successive passages through Chenopodium quinoa. Reverse Transcriptase Polimerase Chain Reaction (RT-PCR) was performed using primers designed from specific regions of the coat protein genes of Japanese allexiviruses available in the Genetic Bank of National Center of Biotechnology Information (NCBI). By these procedures, individual garlic virus genomes were isolated and sequenced. The nucleotide and amino acid sequence analysis and the one with serological data revealed the presence of three distinct allexiviruses GarV-C, GarV-D and a recently described allexivirus, named Garlic mite-borne filamentous virus (GarMbFV), in Brazil.<br>Infecções virais em alho são normalmente causadas por um complexo viral. Neste estudo, um complexo viral de alho, coletado em campo, em três regiões geográficas, foi testado com anti-soros monoclonais específicos para Garlic virus A (GarV-A), Garlic virus B (GarV-B), Garlic virus C (GarV-C) e um anti-soro policlonal capaz de detectar os três vírus mencionados e Garlic virus D (GarV-D). Procedeu-se à amplificação por transcriptase reversa-reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) usando oligonucleotídeos sintetizados a partir de regiões específicas de genes de proteínas capsidiais de allexivirus japoneses e disponíveis no GeneBank (National Center of Biotechnology Information - NCBI). Por esse procedimento, vírus individuais foram isolados e seqüenciados. Os vírus detectados foram biologicamente isolados por meio de sucessivas inoculações em Chenopodium quinoa. A análise das seqüências de nucleotídeos, de aminoácidos e os resultados sorológicos revelaram a presença de três espécies distintas de allexivirus GarV-C, GarV-D e Garlic mite-borne filamentous virus (GarMbFV) no Brasil