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Spectrophotometric determination of etoposide from polymeric implant and application in the study of in vitro release profile Determinação espectrofotométrica de etoposide de implante polimérico e aplicação no estudo do perfil de liberação in vitro
RESUMO Um método espectrofotométrico rápido, simples e econômico foi desenvolvido para a quantificação de etoposídeo em implantes poliméricos e em amostras obtidas a partir do estudo de liberação in vitro. As amostras foram quantificadas a 285 nm. O método foi linear (r 2 > 0,99) na faixa entre 5 e 100 μg/ml, preciso (DPR < 5%), exato (valores de recuperação próximos de 100%), seletivo em relação aos excipientes das amostras, e apresentou limite de quantificação igual a 1,68 μg/ml. O método validado foi empregado com sucesso para análises de rotina de controle de qualidade. Não houve diferença significativa entre os resultados obtidos pelos método espectrofotométrico e HPLC para a determinação de etoposídeo incorporado em implantes biodegradáveis. Palavras chave: Estudos de Validação, Espectrofotometria, Polímero. ABSTRACT A rapid, economical, and simple UV spectrophotometric method was developed for quantification of etoposide in polymeric implants and samples derived from in vitro release study. The samples were quantified at 285 nm wavelength. The method was linear (r 2 > 0.99) over the range of 5 to 100 μg/ml, precise (RSD < 5%), accurate (recovery values close to the 100%), selective regarding excipient of the sample, and had a quantitation limit equal to 1.68 μg/ml. The validated method can be successfully employed for routine quality control analyses. There was no significant difference between the spectrophotometric method and HPLC method for determination of etoposide incorporated into biodegradable devices
Development and validation of a High Performance Liquid Chromatographic method for determination of etoposide in biodegradable polymeric implants
A method using HPLC-UV was developed and validated for the determination of etoposide incorporated into polycaprolactone implants. The method was carried out in isocratic mode using a C18 column (250 x 4.6 mm; 5 µm), at 25 ºC, with acetonitrile and acetic acid 4% (70:30) as mobile phase, a flow rate of 2 mL/min, and UV detection at 285 nm. The method was linear (r² > 0.99) over the range of 5 to 65 µg/mL, precise (RSD < 5%), accurate (recovery of 98.7%), robust, selective regarding excipient of the sample, and had a quantitation limit equal to 1.76 µg/mL. The validated method can be successfully employed for routine quality control analyses
Development of agar diffusion method for dosage of gramicidin
Gramicidin, an antimicrobial peptide active against Gram positive bacteria, is commonly used in pharmaceutical preparations for topical use. Considering that only the turbidimetric method has been described in the literature, the present study sought to develop and validate an agar diffusion method for the dosage of gramicidin. The method was developed and validated using the Kocuria rhizophila ATCC 9341 as a test microorganism. Two designs were used: a 3x3 parallel-line model, and a 5x1 standard curve. The validation demonstrated that the method follows the linear model (r²= 0.994), presenting a significant regression between the zone diameter of growth inhibition and the logarithm of the concentration within the range of 5 to 25.3 µg/mL. The results obtained for both designs were precise, having a relative standard deviation (R.S.D.) for intra-day precision of 0.81 for the 3x3 assay and 1.90 for the 5x1 assay. For the inter-day precision, the R.S.D. was 1.35 for the 3x3 and 2.64 for the 5x1. The accuracy was verified and results confirmed to be accurate, having a tolerance interval of 95%, which lay within permitted limits and appropriate trueness. In addition, the method was considered selective, with limit of detection and upper and lower limits of quantification of 2.00, 5.00 and 25.3 µg/mL, respectively. No difference in precision between the designs used in the agar diffusion method was evident (p>;0.05). The method proved to be appropriate for the microbiological dosage of the raw material gramicidin.A gramicidina, um peptídeo antimicrobiano ativo contra bactérias Gram positivo, é utilizada em preparações farmacêuticas de uso tópico. Neste trabalho procurou-se desenvolver e validar outro método para o doseamento de gramicidina tendo em vista que somente o método turbidimétrico é descrito. O método de difusão em ágar foi desenvolvido e validado utilizando como microrganismo teste Kocuria rhizophila ATCC 9341. Foram utilizados dois delineamentos: retas paralelas 3x3 e curva padrão 5x1. A validação demonstrou que o método segue o modelo linear (r²= 0,994) havendo regressão significativa entre o diâmetro dos halos de inibição e o logaritmo da concentração na faixa de 5,00 a 25,3 µg/mL. Os resultados obtidos por ambos os delineamentos foram precisos apresentando desvio padrão relativo (DPR) para precisão intra-dia de 0,81 para ensaio 3x3 e de 1,90 para ensaio 5x1. Para a precisão inter-dias o DPR foi de 1,35 para 3x3 e de 2,64 para 5x1. A exatidão foi verificada e os resultados foram exatos apresentando intervalo de tolerância a 95% dentro dos limites permitidos e veracidade adequada. O método foi seletivo com limites de detecção e quantificação inferior e superior iguais a 2,00, 5,00 e 25,3 µg/mL, respectivamente. Não foi observada diferença entre a precisão dos delineamentos empregados no método de difusão em ágar (p>;0.05). O método se mostrou adequado para a dosagem microbiológica de gramicidina matéria-prima
Desenvolvimento de métodos microbiológicos para doseamento de gramicidina matéria-prima
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Previous issue date: 28A gramicidina é um pentadecapeptídeo linear antimicrobiano produzido pelo Bacilus brevis e ativo contra bactérias Gram positivo. O método microbiológico turbidimétrico é preconizado para o doseamento de gramicidina (USP 31 e BP 2007). Contudo, não se conseguiu reproduzir a metodologia farmacopéica em laboratório. Além disso, o método por difusão em ágar, uma outra alternativa para o doseamento, não é descrito para este antibiótico. Em vista do exposto, os objetivos deste trabalho foram desenvolver e validar os métodos microbiológicos, por difusão em ágar e turbidimétrico, para o doseamento da gramicidina. O método em placas foi desenvolvido empregando o ágar nutriente e Kocuria rhizophila ATCC 9341 como microrganismo teste. Foram utilizados dois delineamentos: retas paralelas 3x3 e 5x1. A validação do método demonstrou ser linear a relação entre o diâmetro dos halos de inibição e o logaritmo da concentração numa faixa de 5 a 25,3 g/ml. Os resultados obtidos por ambos os delineamentos foram precisos (desvio padrão relativo, DPR, para precisão intra-dia: 0,81 3x3; 1,90 5x1; DPR inter-dias: 1,35 3x3; 2,64 5x1), exatos (intervalo de tolerância a 95% dentro dos limites permitidos) e com veracidade adequada (erros sistemáticos não significativos). Além disso, o método foi seletivo com limites de detecção e quantificação inferior e superior iguais a 2,00; 5,00 e 25,3 g/ml, respectivamente. Não foi observada diferença entre a precisão dos delineamentos empregados no método de difusão em ágar (p>0,05). O método turbidimétrico utilizando caldo GCLT (formulação desenvolvida no laboratório) e Enterococcus hirae ATCC 10541 foi validado. Também foram empregados os delineamentos 3x3 e 5x1. A curva analítica demonstrou ser linear a relação entre a porcentagem de inibição do crescimento microbiano e a concentração de gramicidina no intervalo de 0,08 a 0,88 g/ml. Os resultados obtidos por ambos os delineamentos também foram precisos (DPR intra-dia: 0,18 3x3; 2,32 5x1; DPR inter-dias: 0,69 3x3; 2,47 5x1), exatos e com veracidade adequada. Os limites de detecção, de quantificação inferior e superior foram iguais a 0,06; 0,08 e 0,88 g/ml, respectivamente. Quando o delineamento 3x3 foi utilizado para o método turbidimétrico, resultados mais precisos foram obtidos. Foi verificada a inexistência de diferença significativa entre as precisões dos dois métodos quando o delineamento 3x3 foi empregado e nem quando o 5x1 foi utilizado.Gramicidin is a linear N-formylated pentadecapeptide-ethanolamide complex and active against Gram-positive organisms. It was first isolated from Bacillus brevis. The turbidimetric method is described in the United States Pharmacopoeia and British Pharmacopoeia to analyze gramicidin. Moreover, the results obtained in this assay were no satisfactory. The diffusion method is no described to analyze gramicidin. The present study reports the development and validation of the microbiological assays, applying the cylinder-plate and tube-assay, for the quantitation of gramicidin in raw material. The cylinder-plate method was developed using nutrient agar and a strain of Kocuria rhizophila ATCC 9341 as the test organism. The 3x3 and 5x1 experimental designs were applied. The validation of the method demonstrated that the method was precise (intra-assay: R.S.D. 0.81 3x3; 1.90 5x1; inter-assay: R.S.D. 1.35 3x3; 2.64 5x1), accurate (the 95% tolerance interval obtained was totally included within the acceptance limits) and selective. The calibration curve was linear from 5.00 to 25.3 g/ml. The detection, lower and upper quantification limit were 2.00; 5.00 and 25.3 g/ml, respectively. The F-test indicated that there is no significant difference between the two designs applied in the diffusion assay. The turbidimetric method was developed using GCLT broth (formulated in the laboratory) and Enterococcus hirae ATCC 10541 as the test organism. Also the 3x3 and 5x1 experimental designs were applied. The calibration curve was linear from 0.08 to 0.88 g/ml. The results obtained in this assay were precise (intra-assay: R.S.D. 0.18 3x3; 2.32 5x1; inter-assay: R.S.D. 0.69 3x3; 2.47 5x1) and accurate (the 95% tolerance interval obtained was totally included within the acceptance limits). The detection, lower and upper quantitation limit were 0.06; 0.08 and 0.88 g/ml, respectively. When turbidimetric assay was used, the 3x3 design was more precise than 5x1. The F-test indicated that there is no significant difference between the precision of two methods (p>0,05)
Desenvolvimento de implantes poliméricos intraoculares contendo etoposídeo destinados ao tratamento do retinoblastoma
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Previous issue date: 12O retinoblastoma é um tumor maligno intraocular mais comum na infância e seu tratamento por quimioterapia sistêmica apresenta algumas devantagens: penetração limitada do fármaco no segmento posterior do globo ocular e toxicidade sistêmica. Os implantes intraoculares rpresentam uma alternativa promissora para o tratamento de retinoblastoma. Além disso, esses sistemas são capazes de proteger os fármacos instáveis nas condições fisiológicas, como é o caso do etoposídeo, antitumoral comumente empregado na quimioterapia sistêmica do retinoblastoma, pouco solúvel em água e instável em meios ácido e alcalino. A poli(-caprolactona)(PCL) e o ácido poli-lático-co-glicólico (PLGA) são polímeros biodegradáveis e biocompatíveis extensamente utilizados em sistemas de liberação de fármacos. Neste trabalho, dois sistemas poliméricos cilíndricos foram desenvolvidos: implantes constituídos de PCL e etoposídeo; e implantes de PLGA incorporados de etoposídeo. Ambos os sistemas foram analisados pelas técnicas de espectrofotometria na região do infravermelho por transformada de Fourier, difração de raios-X, termogravimetria, caloria exploratória diferencial e microscopia eletrônica de varredura. Além disso, os implantes foram submetidos ao teste de esterilidade, ao ensaio de uniformidade de conteúdo e à avaliação da estabilidade frente à radiação ultravioleta por trinta minutos. Também foi determinada o perfil de liberação in vitro do fármaco a partir dos implantes e avaliada a tolerância ocular por meio do teste em membrana córion-alantóide de ovo embrionado de galinha (Teste HET-CAM). Adicionalmente, os implantes constituídos por PLGA e etoposídeo foram submetidos ao estudo de liberação in vivo do fármaco. Para quantificação de etoposídeo nas diferentes amostras (implantes de PCL, implantes de PLGA e humor vítreo), métodos por cromatografia líquida de alta eficiência foram desenvolvidos e validados. Os resultados obtidos demonstram que foi possível preparar implantes biodegradáveis cilíndricos. As diferentes técnicas de caracterização revelaram que o fármaco manteve sua integridade química após incorporação às matrizes poliméricas e após a esterilização. Os sistemas poliméricos propiciaram a liberação in vitro do etoposídeo por um período prolongado (150 dias para os implantes de PCL e 50 dias para os dispositivos de PLGA). No estudo in vivo, os implantes de PLGA propiciaram a liberação de aproximadamente 63% do antitumoral por 42 dias e mantiveram concentração intravítrea na faixa de 1,1 a 2,5 ug/ml. Os implantes foram classificados como não irritantes de acordo com o Teste HET-CAM, sugerindo que esses sistemas serão bem tolerados após inserção na cavidade vítrea do olho. Os métodos analíticos desenvolvidos apresentaram seletividade, linearidade, exatidão, precisão e robustez adequadas para a quantificação de etoposídeo no humor vítreo e nos implantes poliméricos. Os resultados obtidos sugerem que os implantes poliméricos contendo etoposídeo representam um potencial sistema de liberação de fármacos para o tratamento do retinoblastoma.Retinoblastoma is an intraocular most common childhood malignancy and its treatment by systemic chemotherapy has some devantagens: limited penetration of the drug to the posterior segment of the eyeball and systemic toxicity. The intraocular implants rpresentam a promising alternative for the treatment of retinoblastoma. Moreover, these systems are able to protect labile drugs in physiological conditions, such as etoposide, commonly employed anti-tumor systemic chemotherapy retinoblastoma, slightly soluble in water and unstable in acid and alkaline media. The poly (-caprolactone) (PCL) and poly-lactic-co-glycolic acid (PLGA) are biodegradable and biocompatible polymer widely used in drug delivery systems. In this work, two cylindrical polymer systems were developed: implants made of PCL and etoposide; PLGA implants embedded and etoposide. Both systems were analyzed by techniques of spectrophotometry in the infrared Fourier transform, X-ray diffraction, thermogravimetry, differential scanning calorie and scanning electron microscopy. Furthermore, the implants were submitted to the sterility test, the content uniformity test and the evaluation of stability to ultraviolet radiation for thirty minutes. Also determined the profile of the in vitro drug release from implants and ocular tolerance assessed by means of the test-chorion allantois of embryonated chicken egg membrane (HET-CAM test). Additionally, the implants made of PLGA and etoposide were submitted to the study of in vivo release of the drug. For quantitation in the different samples etoposide (PCL implants, PLGA implants and vitreous humor), methods by liquid chromatography of high efficiency have been developed and validated. The results show that it was possible to prepare cylindrical biodegradable implants. The various characterization techniques showed that the drug has maintained its chemical integrity upon incorporation into the polymer matrix and after sterilization. Polymeric systems enabled the in vitro release of etoposide over a prolonged period (150 days for PCL implants and 50 days for the devices PLGA). In the in vivo study, the PLGA implants led to the release of approximately 63% of the antitumor for 42 days and kept intravitreal concentrations ranging from 1.1 to 2.5 g / ml. The implants were classified as non-irritant according to the HET-CAM test, suggesting that these systems will be well tolerated after insertion into the vitreous cavity of the eye. The developed analytical methods showed selectivity, linearity, accuracy, precision and robustness adequate for quantification of etoposide in the vitreous humor and in the polymeric implants. The results suggest that the polymeric implants containing etoposide represent a potential delivery system for drugs for the treatment of retinoblastoma
Etoposide-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) intravitreal implants : In vitro and In vivo evaluation.
Etoposide-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) implants were developed for intravitreal application. Implants were prepared by a solvent-casting method and characterized in terms of content uniformity, morphology, drug-polymer interaction, stability, and sterility. In vitro drug release was investigated and the implant degradation was monitored by the percent of mass loss. Implants were inserted into the vitreous cavity of rabbits? eye and the in vivo etoposide release profile was determined. Clinical examination and the Hen Egg Test-Chorioallantoic Membrane (HET-CAM) method were performed to evaluate the implant tolerance. The original chemical structure of the etoposide was preserved after incorporation in the polymeric matrix, which the drug was dispersed uniformly. In vitro, implants promoted sustained release of the drug and approximately 57% of the etoposide was released in 50 days. In vivo, devices released approximately 63% of the loaded drug in 42 days. Ophthalmic examination and HET-CAM assay revealed no evidence of toxic effects of implants. These results tend to show that etoposide-loaded implants could be potentially useful as an intraocular etoposide delivery system in the future
Etoposide-Loaded Poly(Lactic-co-Glycolic Acid) Intravitreal Implants: In Vitro and In Vivo Evaluation
Etoposide-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) implants were developed for intravitreal application. Implants were prepared by a solvent-casting method and characterized in terms of content uniformity, morphology, drug-polymer interaction, stability, and sterility. In vitro drug release was investigated and the implant degradation was monitored by the percent of mass loss. Implants were inserted into the vitreous cavity of rabbits? eye and the in vivo etoposide release profile was determined. Clinical examination and the Hen Egg Test-Chorioallantoic Membrane (HET-CAM) method were performed to evaluate the implant tolerance. The original chemical structure of the etoposide was preserved after incorporation in the polymeric matrix, which the drug was dispersed uniformly. In vitro, implants promoted sustained release of the drug and approximately 57% of the etoposide was released in 50 days. In vivo, devices released approximately 63% of the loaded drug in 42 days. Ophthalmic examination and HET-CAM assay revealed no evidence of toxic effects of implants. These results tend to show that etoposide-loaded implants could be potentially useful as an intraocular etoposide delivery system in the future