Interaction of the Deubiquitinating Enzyme Ubp2 and the E3 Ligase Rsp5 Is Required for Transporter/Receptor Sorting in the Multivesicular Body Pathway

Protein ubiquitination is essential for many events linked to intracellular protein trafficking. We sought to elucidate the possible involvement of the S. cerevisiae deubiquitinating enzyme Ubp2 in transporter and receptor trafficking after we (this study) and others established that affinity purified Ubp2 interacts stably with the E3 ubiquitin ligase Rsp5 and the (ubiquitin associated) UBA domain containing protein Rup1. UBP2 interacts genetically with RSP5, while Rup1 facilitates the tethering of Ubp2 to Rsp5 via a PPPSY motif. Using the uracil permease Fur4 as a model reporter system, we establish a role for Ubp2 in membrane protein turnover. Similar to hypomorphic rsp5 alleles, cells deleted for UBP2 exhibited a temporal stabilization of Fur4 at the plasma membrane, indicative of perturbed protein trafficking. This defect was ubiquitin dependent, as a Fur4 N-terminal ubiquitin fusion construct bypassed the block and restored sorting in the mutant. Moreover, the defect was absent in conditions where recycling was absent, implicating Ubp2 in sorting at the multivesicular body. Taken together, our data suggest a previously overlooked role for Ubp2 as a positive regulator of Rsp5-mediated membrane protein trafficking subsequent to endocytosis

Identification et caractérisation de nouveaux acteurs de deux voies de trafic intracellulaire : le recyclage et l'autophagie dans la levure Saccharomyces cerevisiae

During endocytosis, plasma membrane (PM) cargoes are internalized and targeted to the early endosomes (EE) and the multivesicular bodies (MVBs) before reaching the lysosome/vacuole where they are degraded. Sorting of proteins to invaginated regions of the MVBs is a process conserved from yeast to mammals and dependent on the ESCRTs complexes. Deficiencies in the ESCRT machinery lead to the formation of an abnormal endosomal compartment (Cl E) and to the accumulation of various cargoes at the PM. We show that in S. cerevisiae the stabilization of the uracil permease (Fur4p) at the PM in ESCRTs mutants is due to an enhanced recycling of the endocytosed protein. Fur4p does not pass through the Golgi apparatus on its road from the Cl E compartment to the PM. We thus show a new recycling pathway, different from the one described for the v-SNARE Snc1p. Fur4p can also recycle from the EE and, in this case, follows the same road as Snc1p, suggesting a previously non-expected complexity of recycling pathways in yeast.We also studied 2 EH domain proteins Irs4p and Tax4p, a domain typically found in proteins involved in endocytosis and recycling. Irs4p and Tax4p are not necessary for those processes but display a redundant function in autophagy, a catabolic transport of fractions of cytoplasm or organelles to the lysosome/vacuole. Irs4p and Tax4p interact physically with the autophagic machinery and are partially localized to the Pre-Autophagosomal Structure, the yeast perivacuolar site where autophagosomes are formed. These results show the involvement of a new class of proteins in autophagy and extend the known functions of the EH domain proteins to a new trafficking pathway.Au cours de l'endocytose, les cargos de membrane plasmique (PM) sont internalisés puis dirigés vers l'endosome précoce (EE), les corps multivésiculaires (MVBs), puis le lysosome/vacuole pour dégradation. Le ciblage des protéines vers les zones invaginées des MVBs requiert l'action des complexes ESCRTs. Chez la levure comme chez les mammifères, les mutants déficients pour ces complexes présentent un compartiment endosomal anormal (Cl E) et une accumulation à la PM de diverses protéines. Nous avons montré que chez S. cerevisiae la stabilisation de la perméase à uracile (Fur4p) à la PM dans les mutants ESCRTs résulte de son recyclage vers la PM après internalisation. Fur4p ne traverse pas les compartiments Golgiens lors de son recyclage depuis le compartiment Cl E. Cette voie de recyclage est distincte de celle empruntée par la v-SNARE Snc1p. Fur4p est également capable de recycler depuis l'EE et suit alors la même voie de recyclage que Snc1p. Ceci suggère une complexité inattendue des voies de recyclage chez la levure.Nous nous sommes aussi intéressés à Irs4p et Tax4p, 2 protéines à domaine EH, un domaine trouvé jusqu'alors dans des protéines impliquées dans l'endocytose ou le recyclage. Irs4p et Tax4p ne sont pas impliquées dans ces processus mais interviennent de façon redondante au cours de l'autophagie, un transport catabolique vésiculaire de fractions de cytoplasme ou d'organelles vers le lysosome/vacuole. Irs4p et Tax4p interagissent physiquement avec la machinerie d'autophagie et sont partiellement localisées à la structure Pré-autophagosomale, d'où émanent les vésicules d'autophagie. Ces résultats étendent donc la panoplie des fonctions des protéines à domaine EH

Docteur mais pas chercheur : quels usages et représentations des compétences scientifiques et transversales ?

International audienceCette recherche vise à identifier, dans le cadre de la formation doctorale suivie d’une seconde expérience de recherche, quelles compétences acquises sont mises en œuvre lorsque le docteur occupe ensuite une activité professionnelle éloignée de la recherche. Une approche exploratoire qualitative par récits de vie auprès de dix docteurs exerçant une activité professionnelle en dehors des métiers et du secteur de la recherche a permis de mettre en évidence les compétences scientifiques et transversales acquises et encore mobilisées aujourd’hui ainsi que les usages qui en sont faits . Il en ressort que les docteurs éloignés de la recherche gardent une posture de chercheur par la mobilisation de compétences liées aux activités de recherche mais que ces mêmes compétences sont détournées de leur finalité première (qui est la recherche). Cette stratégie qui est le plus souvent involontaire apporte aux docteurs qui ne sont pas chercheurs une plus-value non négligeable au sein de leur organisation

La construction de la carrière des docteurs se dirigeant dans le secteur privé: De l’entrée en doctorat jusqu’aux docteurs expérimentés

La diversification des carrières des docteurs nous a conduits à vouloir élucider leurs mécanismes de carrière sur la durée. En effet, faire carrière dans l'Enseignement Supérieur et la Recherche académique n'étant plus la seule motivation des docteurs, il semble important de comprendre (1) les autres raisons qui conduisent au doctorat, (2) les raisons qui conduisent les docteurs à choisir le secteur privé comme secteur d'exercice et (3) leur évolution vers une variété de métiers au sein de ce secteur. Afin d'aborder cette problématique, nous avons choisi d'utiliser une méthodologie d'entretien semi-directif sur un échantillon de 10 docteurs issus de différentes disciplines, équilibré en matière de genre, et sur l’ensemble de la carrière ( de 3, à plus de 20 ans après la soutenance de doctorat).Ainsi, le doctorat peut être entrepris pour différents types de motivations : bien-sûr comme un pré-requis pour entreprendre une carrière académique, mais aussi pour acquérir une plus-value pour des métiers d’expertise en entreprise ou enfin, par goût pour la recherche, sans projet préconçu ou sans avoir de préférence entre les secteurs public et privé.Pour certains, le projet professionnel en faveur du secteur privé va se créer ou se renforcer au cours de l’expérience doctorale, soit par « évidence », soit parce qu’ils découvrent que l’environnement de la recherche académique ne leur correspond pas, soit par manque d’opportunités qui y sont offertes.Une fois en entreprise, la carrière des docteurs se façonne de manière cohérente avec les carrières des cadres, au fil des ans et des envies, tantôt suite à une nouvelle opportunité professionnelle offerte, tantôt par rejet de leur poste, parfois aussi de manière contrainte à cause du contexte socioéconomique et enfin, parfois par passion pour un nouveau projet ou un nouvel environnement de travail.Tous nos participants, sans exception, ont exprimé une satisfaction à l’égard de leur parcours professionnel. Ainsi l’ensemble de nos participants, y compris ceux qui envisageaient initialement une carrière dans la recherche académique, se déclare avec le recul satisfaits de leur parcours professionnel. Cette étude a également démontré un lien entre satisfaction et concrétisation, ou non, du projet professionnel initial. En effet, plus la projection dans le secteur privé a été préparée et anticipée par le docteur, plus le sentiment de satisfaction au regard du parcours professionnel a été rapide.Enfin, l’étude a identifié un trait commun à l’ensemble des docteurs interrogés que nous avons qualifié d’« âme de chercheur ». Cette dernière continue en effet de s’exprimer chez l’ensemble des participants quelle que soit leur activité, soit dans leur manière d’appréhender leur métier, dans le type d’environnement qu’ils choisissent pour s’épanouir ou dans leurs méthodes de travail. Tous ont ainsi mis en évidence leur lien constant avec l’innovation et plus généralement la recherche

Docteur mais pas chercheur : quels usages et représentations des compétences scientifiques et transversales ?

International audienceCette recherche vise à identifier, dans le cadre de la formation doctorale suivie d’une seconde expérience de recherche, quelles compétences acquises sont mises en œuvre lorsque le docteur occupe ensuite une activité professionnelle éloignée de la recherche. Une approche exploratoire qualitative par récits de vie auprès de dix docteurs exerçant une activité professionnelle en dehors des métiers et du secteur de la recherche a permis de mettre en évidence les compétences scientifiques et transversales acquises et encore mobilisées aujourd’hui ainsi que les usages qui en sont faits . Il en ressort que les docteurs éloignés de la recherche gardent une posture de chercheur par la mobilisation de compétences liées aux activités de recherche mais que ces mêmes compétences sont détournées de leur finalité première (qui est la recherche). Cette stratégie qui est le plus souvent involontaire apporte aux docteurs qui ne sont pas chercheurs une plus-value non négligeable au sein de leur organisation

Identification et caractérisation de nouveaux acteurs de deux voies de trafic intracellulaire (le recyclage et l'autophagie dans la levure Saccharomyces Cerevisiae)

PARIS7-Bibliothèque centrale (751132105) / SudocSudocFranceF

Critical role of the C2 domain of the yeast ubiquitin ligase rsp5p at several steps of intracellular trafficking

International audienc

Irs4p and Tax4p: Two Redundant EH Domain Proteins Involved in Autophagy.

International audienceProteins carrying EPS15 homology (EH) domains are present from yeast to mammals. The characterized members of this protein family are all involved in intracellular trafficking, typically endocytosis and endocytic recycling. We focused on two members of this family in Saccharomyces cerevisiae Irs4p and Tax4p, whose functions are less well characterized. We show that the deletion of IRS4 altered the function of a neighboring gene, VPS51, involved in endocytic recycling. The irs4Deltatax4Delta cells complemented for the loss of Vps51p (irs4Deltatax4Delta*) display no defects in endocytosis and endosomal recycling, clearly differentiating these two EH proteins from the other protein family members. Because Irs4p is phosphorylated when autophagy is induced, we studied the potential role of these two proteins in this latter process. We observed a loss of viability upon starvation in irs4Deltatax4Delta* cells because of a delay in bulk autophagy. Irs4p and Tax4p are also required for pexophagy but not for the cytoplasm-to-vacuole pathway. In growing cells, Irs4p and Tax4p colocalized to few cytoplasmic puncta distinct from endosomes and Golgi compartments. In conditions inducing autophagy, Irs4p and Tax4p partially localized to the pre-autophagosomal structure (PAS) and are required to efficiently recruit to the PAS Atg17p, a factor modulating the autophagic response. We propose that Irs4p and Tax4p are two redundant modulators of the autophagic processes acting upstream from Atg17p, possibly in the signaling events leading to the activation of the autophagic machinery in response to starvation

Antagonistic Roles of ESCRT and Vps Class C/HOPS Complexes in the Recycling of Yeast Membrane Proteins

In Saccharomyces cerevisiae, deficiencies in the ESCRT machinery trigger the mistargeting of endocytic and biosynthetic ubiquitinated cargoes to the limiting membrane of the vacuole. Surprisingly, impairment of this machinery also leads to the accumulation of various receptors and transporters at the plasma membrane in both yeast and higher eukaryotes. Using the well-characterized yeast endocytic cargo uracil permease (Fur4p), we show here that the apparent stabilization of the permease at the plasma membrane in ESCRT mutants results from an efficient recycling of the protein. Whereas several proteins as well as internalized dyes are known to be recycled in yeast, little is known about the machinery and molecular mechanisms involved. The SNARE protein Snc1p is the only cargo for which the recycling pathway is well characterized. Unlike Snc1p, endocytosed Fur4p did not pass through the Golgi apparatus en route to the plasma membrane. Although ubiquitination of Fur4p is required for its internalization, deubiquitination is not required for its recycling. In an attempt to identify actors in this new recycling pathway, we found an unexpected phenotype associated with loss of function of the Vps class C complex: cells defective for this complex are impaired for recycling of Fur4p, Snc1p, and the lipophilic dye FM4-64. Genetic analyses indicated that these phenotypes were due to the functioning of the Vps class C complex in trafficking both to and from the late endosomal compartment