In silico identification of coffee genome expressed sequences potentially associated with resistance to diseases

Sequences potentially associated with coffee resistance to diseases were identified by in silico analyses using the database of the Brazilian Coffee Genome Project (BCGP). Keywords corresponding to plant resistance mechanisms to pathogens identified in the literature were used as baits for data mining. Expressed sequence tags (ESTs) related to each of these keywords were identified with tools available in the BCGP bioinformatics platform. A total of 11,300 ESTs were mined. These ESTs were clustered and formed 979 EST-contigs with similarities to chitinases, kinases, cytochrome P450 and nucleotide binding site-leucine rich repeat (NBS-LRR) proteins, as well as with proteins related to disease resistance, pathogenesis, hypersensitivity response (HR) and plant defense responses to diseases. The 140 EST-contigs identified through the keyword NBS-LRR were classified according to function. This classification allowed association of the predicted products of EST-contigs with biological processes, including host defense and apoptosis, and with molecular functions such as nucleotide binding and signal transducer activity. Fisher's exact test was used to examine the significance of differences in contig expression between libraries representing the responses to biotic stress challenges and other libraries from the BCGP. This analysis revealed seven contigs highly similar to catalase, chitinase, protein with a BURP domain and unknown proteins. The involvement of these coffee proteins in plant responses to disease is discussed

Caracterization of expressed sequences from coffee genome potentially related with the resistance to diseases

Seqüências potencialmente envolvidas na resistência do cafeeiro a doenças foram identificadas, por meio de análise in silico, a partir das informações geradas pelo Projeto Brasileiro do Genoma Café (PBGC). Para isso foram usadas três estratégias. Inicialmente, palavras-chave correspondentes a termos relacionados aos mecanismos de resistência de plantas a patógenos foram identificadas na literatura e utilizadas como iscas para a mineração dos dados. Com o auxílio de ferramentas disponíveis na plataforma de bioinformática do PBGC, foram identificadas ESTs (Expressed Sequence Tags) relacionadas a cada uma destas palavras. Outra estratégia utilizada foi a busca por similaridades entre algumas seqüências públicas envolvidas com a resistência do cafeeiro a doenças com as seqüências do PBGC, por meio do programa BLAST. Utilizou-se, também, o Electronic Northern, uma ferramenta desenvolvida pelo Laboratório de Genômica e Expressão (LGE). A mineração, usando as três estratégias, identificou 14.060 seqüências do PBGC. Essas seqüências apresentaram similaridade com proteínas conhecidamente relacionadas com o processo de defesa da planta contra doenças como, por exemplo, quitinase, proteína quinase, citocromo P450, proteína de resistência a doenças, proteína relacionada com patogênese, proteínas com domínio LRR e NBS, proteínas induzidas por hipersensibilidade, entre outras. Os processos biológicos com os quais essas seqüências estão envolvidas incluíram metabolismo, transporte, regulação da transcrição, enovelamento de proteínas, biossíntese entre outros. A análise global baseada em ontologia de função molecular das seqüências obtidas mostrou que os genes estão envolvidos com metabolismo, resposta a estímulos externos, diferenciação celular, ligação a ácidos nucléicos, ligação a nucleotídeos, resposta de defesa, apoptose entre outras. Visando verificar o envolvimento destas seqüências com a resistência do cafeeiro à ferrugem foram desenhados 40 primers para amplificar algumas das seqüências mineradas. Os primers foram desenhados com o programa computacional Primer3 e a estabilidade desses foi verificada por meio do programa PrimerSelect. Diferentes concentrações dos componentes da reação de PCR foram analisadas. Utilizando as condições de reação e amplificação otimizadas, os 40 primers foram testados em 12 genótipos resistentes e 12 susceptíveis a Hemileia vastatrix, fungo causador da ferrugem. Vinte e nove destes 40 primers resultaram em bandas únicas e bem definidas, sendo um polimórfico. Este trabalho permitiu obter, até o momento, um marcador molecular polimórfico entre os indivíduos resistentes e susceptíveis. Esse marcador, denominado CARF 005, amplifica uma região do DNA que corresponde a uma ORF parcial de Coffea arabica que codifica uma proteína de resistência a doenças.Sequences potentially involved with the coffee resistance were identified, by in silico analyses, using information generated by the Projeto Brasileiro do Genoma Café (PBGC). For that, three strategies were used. Initially, keywords related to the plants resistance mechanism to pathogens were searched in scientific literature and used as drivers for data mining. Using the available tools at the PBGC bioinformatics platform, ESTs (Expressed Sequence Tags) related to each one of these words were identified. The search for similarities between some published sequences and sequences from the PBGC, by using the BLAST program was another strategy. The Electronic Northern, a tool developed by the Laboratório de Genômica e Expressão (LGE), was also used. Those strategies allowed the identification of 14,060 sequences of the PBGC. These sequences were similar to proteins known to be related to de plant disease defense process, for instance chitinase, kinase protein, cytochrome P450, disease resistance protein, pathogenesis related protein, LRR and NBS proteins, hypersensibility induced protein among others. The biological processes with witch these sequences are involved included metabolism, transport, transcription regulation, protein folding, biosynthesis and others. The ontology-based global analysis for molecular function showed that the genes are involved with metabolism, external stimulus response, cellular differentiation, nucleic acid binding, nucleotide binding, defense response, apoptosis and others. Aiming to verify the involvement of these sequences with the coffee tree resistance to leaf rust, 40 primers were designed to amplify the mined sequences. The primers were synthesized using the computational program Primer3 and their stability was tested by the program PrimerSelect. Different PCR conditions were tested. Using optimized reaction and amplification conditions, those 40 primers were tested in 12 resistant and 12 susceptible genotypes to Hemileia vastatrix, fungus that causes coffee leaf rust. Twenty nine of those resulted in unique and sharp bands, and only one of these was polymorphic. The 40 primers permitted to find one molecular marker polymorphic between the resistant and susceptible genotypes. This marker amplifies a region of the DNA which corresponds to a Coffea Arabica ORF for disease resistance protein.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superio

Functional characterization and identification of SNPs and coffee disease resistance genes

O Projeto Brasileiro do Genoma Café gerou um banco de dados de 200.000 ESTs (Expressed Sequence Tags). Estas sequências estão armazenadas no banco de dados do Projeto, o CafEST. Em trabalho anterior, foi realizada análise in silico das sequências do CafEST, a qual permitiu a identificação de 14.060 sequências relacionadas com o processo de defesa da planta contra doenças. Dessas 14.060, 1.855 foram sequências cujos produtos preditos eram quitinases. Dada a importância das quitinases, tanto na interação planta-patógeno, como em outros processos da planta, as ESTs de quitinase foram detalhadamente analisadas no presente trabalho. Para isso foi realizada uma caracterização funcional e construído um perfil de expressão in silico. A categorização funcional foi feita com o software Blast2GO e o perfil de expressão gênica in silico foi determinado por meio de análises de Northern Blot Virtual. Os resultados da caracterização funcional mostraram a versatilidade das quitinases, que possuem atividade enzimática e estão envolvidas em importantes processos biológicos e funções moleculares nas células da planta. A análise do perfil de expressão in silico permitiu verificar que as quitinases estão mais expressas, principalmente, em bibliotecas que apresentam algum componente de estresse. Para selecionar, entre as 14.060 sequências mineradas, aquelas que estão envolvidas com a resistência do cafeeiro à ferrugem, foram desenvolvidos, em trabalho anterior, 40 pares de primers. Os primers foram testados em 12 cafeeiros resistentes e 12 susceptíveis a Hemileia vastatrix, fungo causador da ferrugem. Vinte e nove primers resultaram em bandas únicas e bem definidas, sendo que um deles foi polimórfico entre os cafeeiros resistentes e suscetíveis. No presente trabalho, 15 primers monomórficos foram escolhidos para análises de polimorfismos de base única (SNPs Single Nucleotide Polymorphisms) nas sequências de DNA entre os 12 cafeeiros resistentes e 12 susceptíveis a H. vastatrix. As sequências obtidas foram analisadas com os programas Sequencher® v. 4.10, ORF Finder, BLAST e ClustalW. Dos 15 genes, quatro não apresentaram nenhum SNP. Cinco genes apresentaram SNPs, mas os polimorfismos foram observados apenas para o clone da espécie Coffea liberica var. dewevrei (café excelsa). Os outros seis genes foram polimórficos entre os genótipos amostrados. Foram detectados 71 SNPs, sendo que 34 foram transições (47,89%) e 37 transversões (52,11%). A taxa de transições/ transversões foi de 0,9189. Das 71 substituições, 27 ocorreram na primeira posição do códon (38,02%), 15 na segunda posição (21,12%) e 29 na terceira (40,84%). Foram detectadas 11 (15,49%) substituições sinônimas e 60 (84,51%) substituições não sinônimas. A relação de substituições sinônimas/não sinônimas foi de 0,1833. Um alto nível de mutações não sinônimas, como o que foi encontrado neste trabalho, pode ser reflexo de seleção positiva. Um exemplo é o cenário antagonista da coevolução patógeno-hospedeiro, onde os genes do hospedeiro estão engajados numa corrida armamentista evolucionária e sob forte pressão de seleção para mudarem e se adaptarem. Em função disso, eles evoluem numa taxa mais rápida que outros genes. Este cenário pode ser aplicado ao presente trabalho, dado o alto nível de modificações não sinônimas detectado e ao fato que os genes analisados atuam, de alguma forma, no processo de defesa do cafeeiro contra patógenos. Foi observada uma frequência de 0,1029 SNPs por amplicon. Nos 119.061 pb analisados detectou-se uma frequência extremamente baixa de 1 SNP a cada 1.676,91pb, ou de 0,0596 SNPs por 100 pb. Pode-se atribuir o baixo nível de polimorfismo observado à baixa diversidade do genoma de C. arabica. A análise dos produtos gênicos permitiu verificar que as mutações não sinônimas identificadas não levaram à formação de proteínas preditas distintas. No presente trabalho foi também iniciada a clonagem de um gene potencialmente envolvido com a resistência do cafeeiro a ferrugem. Em trabalho anterior, foi identificado um fragmento de gene de resistência, amplificado pelo primer CARF 005, presente nos indivíduos resistentes e ausente nos susceptíveis à ferrugem do cafeeiro. Esse primer foi utilizado no presente trabalho para realizar um screening de uma biblioteca de BACs (Bacterial Artificial Chromosome Cromossomo Artificial de Bactéria) contendo 56.832 clones Na identificação do(s) clone(s) positivo(s), utilizou-se o método de decomposição de pools. Foram identificados dois clones positivos (i. e. dois clones contendo fragmento de gene de resistência amplificado pelo marcador CARF 005). Os dados de sequenciamento dos dois clones identificados poderão fornecer informações importantes sobre a estrutura dos genes de resistência em Coffea.The Brazilian Coffee Genome Project has generated a database of 200,000 ESTs (Expressed Sequence Tags). These sequences are stored in the Project database, the CafEST. In silico analysis of the CafEST sequences was performed in previous work. It allowed the identification of 14,060 sequences related to the process of plant defense against diseases. Of the 14,060, 1,855 were sequences whose predicted products were chitinases. Given the importance of chitinases, both in plant-pathogen interaction, as in other plant processes, the chitinases ESTs were thoroughly analyzed in this study. For that, a functional characterization was carried out and an in silico expression profile was built. The functional categorization was accomplished using the Blast2GO software, and the in silico gene expression profile was determined by virtual Northern Blot Analysis. The results of functional characterization showed the versatility of chitinases, which have enzymatic activity and are involved in important biological processes and molecular functions in the plant cells. The in silico expression profile analysis has shown that chitinases are more expressed especially in libraries that have some component of stress. To select among the 14,060 sequences mined, those which are involved in the resistance of coffee to rust, a set of 40 pairs of primers were designed in previous work. The primers were tested on 24 coffee trees: 12 resistant and 12 susceptible to Hemileia vastatrix, fungus that causes leaf rust. Twenty-nine primers resulted in unique and well defined bands, one of which was polymorphic between resistant and susceptible trees. Of these primers, 15 were chosen for Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) analysis in DNA sequences between 12 H. vastatrix resistant trees and 12 susceptible ones. The sequences obtained were analyzed with the Sequencher® v.4.10, ORF Finder, BLAST and ClustalW programs. Of the 15 genes, four were monomorphic. Five genes showed polymorphism only for the Coffea liberica var. dewevrei species clone. The other six genes were polymorphic among the sampled genotypes. Seventy one SNPs were detected, of which 34 were transitions (47.89%) and 37 (52.11%) were transversions. The rate of transitions/ transversions was 0.9189. Of the 71 substitutions, 27 (38.02%) occurred in the first codon position, 15 (21.12%) in the second position and 29 (40.84%) in the third. Eleven (15.49%) synonymous and 60 (84.51%) nonsynonymous substitutions were detected. The ratio of synonymous/ nonsynonymous substitutions was 0.1833. A high level of non-synonymous mutations, as was found in this study, may reflect positive selection. An example is the antagonist scenario of the host-pathogen coevolution, where the host genes are engaged in an "arms race" and under strong evolutionary selection pressure to change and adapt. As a result, they evolve at a faster rate than other genes. This scenario can be applied to this work, given the high level of nonsynonymous changes detected and the fact that the analyzed genes somehow act in the defense against coffee pathogens. A frequency of 0.1029 SNPs per amplicon was observed. In the 119,061 bp analyzed, an extremely low frequency of 1 SNP every 1,676.91 bp or 0.0596 SNPs per 100 bp was detected. The low polymorphism level observed can be attributed to the low diversity of the C. arabica genome. The gene products analysis has shown that the nonsynonymous mutations do not lead to formation of distinct predicted proteins. Also, in the present work, the cloning of a gene potentially involved in resistance to coffee rust was initiated. In previous work, a resistance gene fragment was identified. The fragment, amplified by primer CARF 005, is present in the resistant individuals and absent in the coffee leaf rust susceptible genotypes. This primer was used in this study to perform a screening of a BAC (Bacterial Artificial Chromosome) library containing 56,832 clones. The pools fragmentation method was used to identify the positive clone(s). Two positive clones (i.e. two clones containing the resistance gene fragment amplified by marker CARF 005) were identified. The sequencing data from the two identified clones may provide important information about the structure of disease resistance genes in Coffea.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superio

Marcadores moleculares derivados de sequências expressas do genoma café potencialmente envolvidas na resistência à ferrugem

The objective of this work was to identify molecular markers related to the resistance of coffee (Coffea arabica) to rust (Hemileia vastatrix). DNA sequences potentially involved in coffee disease resistance were identified, using “in silico” analysis, from data obtained by the Brazilian coffee genome project. After data mining, 59 primer pairs were designed to amplify the sequences identified. The 59 primers were tested on 12 resistant and 12 susceptible coffee plants to H. vastatrix. Twenty-seven primers resulted in unique and well‑defined bands, while one of these amplified a DNA fragment in all resistant plants, but not in the susceptible ones. This polymorphic molecular marker amplified a region of DNA that corresponds to a partial open reading frame of C. arabica genome that encodes a disease resistance protein. The marker CARF 005 can be used to differentiate between resistant and susceptible coffee plants to H. vastatrix.O objetivo deste trabalho foi identificar marcadores moleculares relacionados à resistência do cafeeiro (Coffea arabica) à ferrugem (Hemileia vastatrix). Foram identificadas sequências de DNA potencialmente envolvidas na resistência do cafeeiro a doenças, por meio de análise “in silico”, a partir das informações geradas pelo Projeto Brasileiro do Genoma Café. A partir das sequências mineradas, foram desenhados 59 pares de iniciadores para amplificá‑las. Os 59 iniciadores foram testados em 12 cafeeiros resistentes e 12 susceptíveis a H. vastatrix. Vinte e sete iniciadores resultaram em bandas únicas e bem definidas, enquanto um deles amplificou fragmento de DNA em todos os cafeeiros resistentes, mas não nos suscetíveis. Esse marcador molecular polimórfico amplificou uma região do DNA que corresponde a uma janela aberta de leitura parcial do genoma de C. arabica que codifica uma proteína de resistência a doenças. O marcador CARF 005 é capaz de diferenciar os cafeeiros analisados em resistentes e susceptíveis a H. vastatrix