Extraction of organotin species in sediment employing solid phase microextraction coupled to graphite furnace and total tin determination by slurry sampling

Orientadores: Marco Aurelio Zezzi Arruda, Fabio AugustoTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de QuimicaResumo: Este trabalho de Tese visa acoplar a fibra, empregada em microextração em fase sólida (SPME, do inglês solid phase microextraction), ao espectrômetro de absorção atômica com forno de grafite (GF AAS, do inglês graphite furnace atomic absorption spectrometer), visando reter espécies organometálicas volatilizadas nas etapas de secagem e pirólise do GF AAS. O elemento escolhido para avaliar o acoplamento SPME-GF AAS foi o Sn. Primeiramente, a concentração total de Sn foi determinada, utilizando a amostragem em suspensão como estratégia, uma vez que na avaliação da distribuição dos compostos organoestânicos por SPME-GF AAS, a concentração total de Sn seria efetuada a partir de uma suspensão. Para a otimização do método foram avaliados os seguintes parâmetros: solução de preparo da suspensão, e efeito da temperatura de pirólise e atomização. A mistura contendo HF 10 % (v/v) e HNO3 1 % (v/v) foi escolhida para preparar a suspensão, a composição Mg(NO3)2 + NH4H2PO4 apresentou resultados apropriados para ser utilizada como modificador químico convencional, e 1000 e 2200 °C foram as temperaturas ótimas para a pirólise e a atomização, respectivamente. Devido ao efeito de matriz, foi utilizada a técnica de adição de analito para a quantificação de Sn em suspensões de sedimento marinho e de rio, em que os limites de detecção e quantificação calculados foram de 1,5-2,6 e 4,5- 7,6 µg g, respectivamente. Para avaliar o acoplamento SPME-GF AAS, visando à retenção das espécies organoestânicas (butiltricloroestanho, dibutildicloroestanho e tributilcloroestanho) foi utilizada, primeiramente, uma suspensão de sedimento. A suspensão foi sonicada e, em seguida, uma alíquota foi injetada no forno de grafite do GF AAS juntamente com o reagente de derivação (tetraetilborato de sódio - NaBEt4). A programação do forno de grafite foi aplicada e a fibra de SPME foi introduzida no atomizador. Após a retenção das espécies de interesse na fibra, a mesma foi conduzida ao cromatógrafo a gás (CG) para a separação e detecção dos analitos. Os parâmetros instrumentais do CG foram previamente estudados, visando a melhor separação das espécies de interesse. Esses estudos foram realizados utilizando o modo de extração por headspace e SPME (HS-SPME, do inglês headspace-solid phase microextraction). Em relação aos estudos envolvendo suspensões de sedimento no acoplamento proposto SPME-GF AAS, alguns parâmetros foram avaliados frente à retenção das espécies de interesse; entre eles pode-se citar o tipo de fibra, a concentração do reagente de derivação e o pH da reação. Melhores resultados foram observados para a fibra PDMS/DVB, utilizando uma concentração de 0,2 % (m/v) de NaBEt4 para a etilação das espécies de interesse, sendo a reação realizada em pH 5,0. Entretanto, baixa eficiência de retenção (< 20 %) das espécies de interesse em suspensão de sedimento, foi obtida utilizando-se o acoplamento SPME-GF AAS, quando comparada à extração por HS-SPME. Dessa forma, foi realizada uma extração das espécies de interesse das amostras de sedimento, utilizando a energia ultrassônica, anteriormente à sua aplicação no acoplamento proposto SPME-GF AAS. Nesta etapa do trabalho, a temperatura do forno de grafite e o tempo de exposição da fibra de SPME no forno de grafite foram otimizados, visando à máxima eficiência de retenção das espécies de interesse no acoplamento SPME-GF AAS. Os melhores resultados foram observados para temperaturas do forno de grafite de 90 °C, com 986 s de tempo de exposição da fibra no atomizador. Por fim, foram realizados experimentos visando determinar a concentração total de Sn, e reter suas espécies organometálicas simultaneamente, na fibra de SPME, utilizando o acoplamento SPME-GF AAS.Abstract: The goal of this Thesis was coupling the solid phase microextraction (SPME) to graphite furnace atomic absorption spectrometer (GF AAS) for extracting the organometallic species volatilized in the drying and pyrolysis steps of the GF AAS. For evaluating the SPME-GF AAS coupling, Sn was then chosen. Firstly, the total Sn concentration using the slurry sampling strategy was determined, once in the evaluation of the organotin compounds by SPME-GF AAS, the total Sn concentration would be obtained from a slurry solution. Some parameters were evaluated, such as the nature of the solution to prepare the slurry, and pyrolysis and atomization temperatures effects. The mixture of 10 % (v/v) HF plus 1 % (v/v) HNO3 was chosen to prepare the sediment slurries, the Mg(NO3)2 plus NH4H2PO4 was appropriated as conventional chemical modifier, and the values of 1000 and 2000 °C was used as pyrolysis and atomization temperatures, respectively. The analyte addition was used in the Sn determination in sediment (marine and river) samples by slurry sampling due to matrix effects. The detection and quantification limits were calculated as 1.5-2.6 and 4.5-7.6 µg g, respectively. For evaluating the SPME-GF AAS coupling in the extraction of organotin species (butyltrichloride, dibutyldichloride, and tributylchloride), a sediment slurry was firstly used. For this task, the slurry was sonicated and an aliquot of this solution plus the derivatization reagent (sodium tetraethylborate ¿ NaBEt4) were introducted consecutively into the graphite furnace of the GF AAS. Then, the graphite furnace program was applied, and the SPME fiber was exposed into the furnace. After the extraction of organotin species by SPME-GF AAS, the analytes were separated and detected by gas chromatography (GC). Before this procedure, instrumental parameters of the GC were studied. For this task, it was used the conventional extraction by HSSPME (headspace-solid phase microextraction). Related to studies of SPME-GF AAS coupling, employing slurry sampling, some parameters, such as fiber coating, derivatization reagent concentration, pH of the reaction, among others, were evaluated. Satisfactory results were obtained using the PDMS/DVB fiber in the presence of 0.2 % (m/v) NaBEt4 and pH 5.0. However, low extraction efficiency (< 20 %) was obtained, using the SPME-GF AAS coupling for organotin species extraction from sediment slurries, when comparing to HS-SPME extractions. Then, the extraction of organotin species from sediment samples, using the ultrasonic energy was carried out, before the sample introduction into the SPME-GF AAS coupling. In this step, the graphite furnace temperature and the fiber exposure time in the atomizer were optimized. The better results were noted when 90 °C as the graphite furnace temperature was used, and 986 s was attributed as the fiber exposure time into the atomizer. Additionally, the determination of total Sn concentration, and the extraction of organotin species in the SPME fiber, using the SPME-GF AAS coupling, was simultaneously carried out.DoutoradoQuimica AnaliticaDoutor em Ciência

Extration and fractionation of blood plasma proteins based on cloud point procedure

Orientador: Marco Aurelio Zezzi ArrudaDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de QuimicaMestradoQuimica AnaliticaMestre em Químic

Processo De Semipurificação E Extração De Proteìnas De Plasma Sangüìneo Humano E Animal E Kit Para Marcador De Peso Molecular Protéico, Baseado Em Sistema De Duas Fases Empregando Surfactante

Processo de semipurificação e extração de proteínas de plasma sanguíneo humano e animal e kit para marcador de peso molecular protéico, baseado em sistema de duas empregando surfactante. A presente invenção se trata de processo de semipurificação de proteínas, preferencialmente, de plasma sanguíneo humano e um kit para marcador de peso molecular proteína utilizando um sistema de separação de fases à base do surfactante não-iânico na presença de eletrólito. Mais especificamente, a presente invenção consiste em um processo de semipurificação e extração de proteínas de plasma sanguíneo humano e na produção de um kit para marcador de peso molecular protéico, baseados na extração micelar, com o emprego do surfactante. Embora o sistema não seja capaz de concentrar uma única fração protéica na fase rica em surfactante, algumas frações protéicas têm preferência em migrar para a fase superior, enquanto outras permanecem na fase inferior. Assim, temos um sistema de separação protéico, uma vez que dividimos um sistema protéico complexo em duas grandes frações. O kit visa diminuir drasticamente o custo na produção do marcador, urna vez que as proteínas extraídas ou migradas para a fase rica em surfactante, depois de identificadas, podem ser utilizadas como referência para estimar o peso molecular.BRPI0501967 (A)G01N33/49BR2005PI01967G01N33/4

Cloud point method applied to the Apolipoprotein A-I extraction from human plasma and its identification by tandem mass spectrometry

This work describes the extraction of the apolipoprotein A-I (apoA-I) from human plasma using the cloud point extraction (CPE). The CPE was carried out with a nonionic surfactant (5 % w/v Triton® X-114), and the presence of a salting-out effect (10 % w/v NaCl) promoted biocompatible separation conditions at room temperature and pH 6.8. The apoA-I present in the surfactant-rich phase was identified by tandem mass spectrometry after two-dimensional gel electrophoresis

Design, Immune Responses and Anti-Tumor Potential of an HPV16 E6E7 Multi-Epitope Vaccine

<div><p>Cervical cancer is a common type of cancer among women worldwide and infection with high-risk human papillomavirus (HPVs) types represents the major risk factor for the etiopathogenesis of the disease. HPV-16 is the most frequently identified HPV type in cervical lesions and expression of E6 and E7 oncoproteins is required for the uncontrolled cellular proliferation. In the present study we report the design and experimental testing of a recombinant multi-epitope protein containing immunogenic epitopes of HPV-16 E6 and E7. Tumor preventive assays, based on the engraftment of TC-1 cells in mice, showed that the E6E7 multi-epitope protein induced a full preventive anti-tumor protection in wild-type mice, as well as in mice deficient in expression of CD4⁺ T cells and TLR4 receptor. Nonetheless, no anti-tumor protection was observed in mice deficient in CD8⁺ T cells. Also, the vaccine promoted high activation of E6/E7-specific T cells and in a therapeutic-approach, E6E7 protein conferred full anti-tumor protection in mice. These results show a potential use of this E6E7 multi-epitope antigen as a new and promising antigen for the development of a therapeutic vaccine against tumors induced by HPV.</p></div

P-I Snake Venom Metalloproteinase Is Able to Activate the Complement System by Direct Cleavage of Central Components of the Cascade

<div><p>Background</p><p>Snake Venom Metalloproteinases (SVMPs) are amongst the key enzymes that contribute to the high toxicity of snake venom. We have recently shown that snake venoms from the <i>Bothrops</i> genus activate the Complement system (C) by promoting direct cleavage of C-components and generating anaphylatoxins, thereby contributing to the pathology and spread of the venom. The aim of the present study was to isolate and characterize the C-activating protease from <i>Bothrops pirajai</i> venom.</p><p>Results</p><p>Using two gel-filtration chromatography steps, a metalloproteinase of 23 kDa that activates Complement was isolated from <i>Bothrops pirajai</i> venom. The mass spectrometric identification of this protein, named here as C-SVMP, revealed peptides that matched sequences from the P-I class of SVMPs. C-SVMP activated the alternative, classical and lectin C-pathways by cleaving the α-chain of C3, C4 and C5, thereby generating anaphylatoxins C3a, C4a and C5a. <i>In vivo</i>, C-SVMP induced consumption of murine complement components, most likely by activation of the pathways and/or by direct cleavage of C3, leading to a reduction of serum lytic activity.</p><p>Conclusion</p><p>We show here that a P-I metalloproteinase from <i>Bothrops pirajai</i> snake venom activated the Complement system by direct cleavage of the central C-components, <i>i.e.</i>, C3, C4 and C5, thereby generating biologically active fragments, such as anaphylatoxins, and by cleaving the C1-Inhibitor, which may affect Complement activation control. These results suggest that direct complement activation by SVMPs may play a role in the progression of symptoms that follow envenomation.</p></div

Anti-tumor responses elicited in mice immunized with E6E7 multi-epitope protein.

<p>Mice were immunized with three doses of PBS/2M urea (PBS) or E6E7 in intervals of 14 days. Mice were challenged with TC-1 tumor cells two weeks after the last dose. (A) Groups of five C57BL/6 mice were immunized as described. (B) TLR4 KO mice (C57BL10/ScCr) were vaccinated with PBS/2M urea (5 mice, PBS) or E6E7 (6 mice). (C) Groups of eight CD4 KO mice were vaccinated with PBS/2M urea (PBS) or E6E7. (D) Groups of five CD8 KO mice were vaccinated with PBS/2M urea (PBS) or E6E7. In parallel, C57BL/6 wild-type mice (5 mice) were used as a control of tumor growth competence. Asterisk indicates statistically significant percentage of tumor-free animals when compared to control group (** p < 0.005).</p

Design and purification of the vaccine antigen.

<p>(A) Scheme of the designed E6E7 antigen. Ala-Ala-Tyr (AAY) spacers were inserted between the epitopes. (B) SDS-PAGE of purified antigen stained with Coomassie Brilliant Blue. MW: molecular mass marker.</p