Gene mining in doubled haploid lines from European maize landraces with association mapping

Since the introduction of maize into Europe, open-pollinated varieties of flint maize were cultivated across the continent. Natural selection promoted adaptation to the climatic conditions prevailing in the different regions. With the advent of hybrid breeding in Europe during the 1950s, some of the genes responsible for the specific adaptations of the landraces to abiotic and biotic stress were captured in the first developed inbred lines, but most of their genetic diversity is still untapped. Development of inbred lines out of this material by recurrent selfing is very tedious due to strong inbreeding depression. In contrast, the doubled-haploid (DH) technology allows producing fully homozygous lines out of landraces in only one step. This allows their precise characterization in replicated trials and identification of new genes by genome wide association (GWA) mapping. In this study we genotyped a set of 132 DH lines derived from European Flint landraces and 364 elite European flint (EU-F), European dent (EU-D) and North-American dent (NA-D) inbred lines with 56,110 single nucleotide polymorphism (SNP) markers. The lines were evaluated in field trials for morphologic and agronomic traits and GWA mapping was performed to identify underlying quantitative trait loci (QTL). In particular, our objectives were to (1) develop a robust method for quantifying early growth with a non-destructive remote-sensing platform, (2) evaluate the importance of early growth performance of inbred lines with regard to their testcross performance, (3) determine the potential of GWA mapping to identify genes underlying early growth and cold tolerance related traits, (4) evaluate the phenotypic and genotypic diversity recovered in the DH lines derived from the landraces, (5) estimate the effect of the DH method on the recovered genetic diversity, (6) identify new genes by GWA mapping in the DH lines derived from landraces, and (8) discuss the potential of DH lines derived from landraces to improve the genetic diversity and performance of elite maize germplasm. A phenotyping platform using spectral reflectance and light curtains was used to perform repeated measurements of biomass and estimate relative growth rates (RGR) of the DH and inbred lines, as well as of two testcrosses of 300 dent inbred lines. The DH lines derived from the landraces Schindelmeiser and Gelber Badischer had the highest RGR followed by EU-F lines, DH lines derived from Bugard, EU-D lines and, finally, NA-D lines. For inbred lines, whole plant dry matter yield (DMY) was positively correlated with RGR (r = 0.49), whereas this relation was weaker in the testcrosses (r = 0.29). RGR of the inbred lines correlated with RGR of their testcrosses (r = 0.42), but it had no influence on testcross DMY. A set of 375 EU-F, EU-D and NA-D lines were further evaluated in growth chambers under chilling (16/13°C) and optimal (27/25°C) temperatures. Photosynthetic and early growth performance were estimated for each treatment and an adaptation index (AI) built as the chilling to optimal performance ratio. Nineteen QTL were identified by GWA mapping for trait performance and AI. Candidate genes involved in ethylene signaling, brassinolide, and lignin biosynthesis were found in their vicinity. Several QTL for photosynthetic performance co-located with previously reported QTL and the QTL identified for shoot dry wieght under optimal conditions co-located with a QTL for RGR. Comparison of the DH lines derived from landraces with the EU-F lines showed that genotypic variances in single DH populations were greater than in the EU-F breeding population. A high average genetic distance among the DH lines derived from the same landrace as well as a rapid decay of linkage disequilibrium suggests a high effective population size of the landraces. Because no systematic phenotypic differences were observed between the landraces and synthetic landraces obtained by intermating the corresponding DH lines, the expected purge of lethal recessive alleles during the DH production did neither improve grain yield performance nor affect the recovered genetic diversity. Performing GWA in the DH lines derived from landraces as well as the EU-F, and EU-D lines allowed the identification of 49 QTL for 27 traits. A larger set of DH lines derived from more landraces might solve problems arising from population structure and allow a much higher power for the detection of new alleles. In conclusion, the introgression of DH lines derived from landraces into the elite breeding material would strongly broaden its genetic base. However, grain yield performance was 22% higher in EU-F lines than in the DH lines derived from landraces. Selection of the best DH lines would allow partially bridging this yield gap and marker-assisted selection may allow introgression of positive QTL without introducing negative features by linkage drag.Seit der Einfuhr von Mais aus der neuen Welt nach Europa, wurden offen abblühende Flint-Mais Populationen auf dem gesamten Kontinent angebaut. Durch natürliche Selektion passten sich diese Landsorten an die Klimate des Kontinents an. In den Anfängen der Hybridzüchtung wurden Gene und Allele, die für diese spezifische Anpassung an biotische und abiotische Stressfaktoren verantwortlich sind, in den ersten Inzuchtlinien nur teilweise fixiert. Der Grossteil der genetischen Vielfalt der Landsorten blieb jedoch ungenutzt, da die Entwicklung von Inzuchtlinien aus diesem Material wegen besonders starker Inzuchtdepression sehr mühsam ist. Demgegenüber erlaubt es die seit etwa 10 Jahre eingesetzte Methode der Erzeugung von Doppel-Haploiden (DH), vollständig homozygote Linien aus Landsorten in einem einzigen Schritt zu entwickeln. Diese DH-Linien können in wiederholten Feldversuchen sehr präzise evaluiert werden. Dies vereinfacht die Kartierung von Genen mithilfe der Genom-weiten Assoziations-Kartierung (GWA) enorm. In der vorliegenden Studie wurden 132 DH-Linien aus europäischen Landsorten, 364 Inzucht-linien aus Nordamerikanischem Dent (NA-D), europäischem Flint (EU-F) und europäischem Dent (EU-D) Zuchtmaterial mit 56110 genetischen Markern genotypisiert. Agronomische Eigenschaften der DH-Linien und Elite-Inzuchtlinien wurden in Feldversuchen evaluiert und mittels GWA kartiert, um vorteilhafte Gene zu identifizieren. Zu unseren Zielen gehörten insbesondere (1) die Entwicklung einer robusten, nicht-destruktiven Methode zur Erfassung der Jugendentwicklung mittels Sensoren, (2) die Untersuchung des Zusammenhangs zwischen der Jugendentwicklung der Linien per se und deren Testkreuzungen, (3) die Erforschung von GWA zur Identifikation von Kühletoleranz- und Jugendentwicklungs-Genen in Elite-Inzuchtlinien, (4) die Evaluierung der aus den Landsorten mittels der DH-Methode geborgene phänotypische und genetische Vielfalt, (5) die Abschätzung eines möglichen Einfluss der DH-Methode auf der genetischen Vielfalt der DH-Linien, (6) die Entdeckung neuer Gene in den DH-Linien aus Landsorten mittels GWA, und (7) die Ermittlung des Potentials von DH-Linien aus Landsorten, um die Leistung und genetische Diversität des modernen Zuchtmaterials zu verbessern. Die Biomasse und relative Wachstumsrate (RGR) der DH-Linien und Elite-Inzuchtlinien sowie je zwei Testkreuzungen von 300 Dent Inzuchtlinien wurden mit Lichtschranken und spektraler Reflektion geschätzt. Die DH-Linien aus den Landsorten Schindelmeiser und Gelber Badischer wiesen die höchste RGR auf, gefolgt von EU-F Linien, DH-Linien aus Bugard, EU-D Linien und zuletzt NA-D Linien. Die Gesamttrockenmasse der Linien war mit deren RGR positiv korreliert (r = 0.49), während diese Korrelationen für die Testkreuzungen schwächer ausfiel (r = 0.29). Die RGR der Linien korrelierte mit der RGR der Testkreuzungen (r = 0.42), hatte jedoch keinen Einfluss auf deren Gesamttrockenmasse. Ein Satz von 375 EU-F, EU-D und NA-D Linien wurde unter kühlen (16/13°C) und optimalen (27/25°C) Temperaturen in Klimakammern untersucht. Die photosynthetische Leistung und die Jugendentwicklung wurden für jedes Verfahren gemessen. Aus dem Verhältnis der Leistungen unter kühlen und optimalen Bedingungen wurde ein Adaptations-Index (AI) berechnet. Neunzehn Genorte (QTL) wurden für verschiedene Merkmale und deren AI mittels GWA identifiziert. Gene mit Beteiligung in der Äthylen-Signalkette, Brassinolid- und Lignin-Biosynthese wurden als Kandidaten identifiziert. Mehrere QTL für photosynthetische Leistung co-lokalisierten mit bereits beschriebenen QTL. Der Vergleich der genetischen Varianzen zeigte, dass diese innerhalb der einzelnen Landsorten grösser ist als innerhalb des EU-F Zuchtmaterials. Sowohl die hohe mittlere genetische Distanz zwischen den DH-Linien einer Landsorte, als auch das rasch abfallende Kopplungs-ungleichgewicht innerhalb der Landsorten deuten auf eine grosse Effektive Populationsgrösse hin. Die erwartete Eliminierung von rezessiven letalen Allelen durch die DH-Methode konnte den Ertrag synthetischer Landsorten nicht erhöhen und hatte auch keinen grossen Einfluss auf die genetische Diversität. Mittels GWA Analyse in den DH-Linien aus Landsorten und in Elite-Inzuchtlinien konnten 49 QTL für 27 Merkmale kartiert werden. Eine grössere Anzahl von DH-Linien aus Landsorten würde es erlauben, die durch Populationsstruktur verursachten Artefakte zu beseitigen und somit die Wahrscheinlichkeit, neue Allele zu entdecken, stark erhöhen. Zusammengefasst kann die genetische Diversität des Zuchtmaterials durch die Einkreuzung von DH-Linien aus Landsorten stark erhöht werden. Der grosse Abstand zwischen der Leistung des Zuchtmaterials und den DH-Linien aus Landsorten (22%) kann durch Selektion der besten DH-Linien teilweise ausgeglichen werden. Marker-gestützte Selektion könnte das Einkreuzen von positiven QTL ohne Introgression von unerwünschten negativen Eigenschaften erleichtern

Unlocking the Genetic Diversity of Maize Landraces with Doubled Haploids Opens New Avenues for Breeding

<div><p>Landraces are valuable genetic resources for broadening the genetic base of elite germplasm in maize. Extensive exploitation of landraces has been hampered by their genetic heterogeneity and heavy genetic load. These limitations may be overcome by the <i>in-vivo</i> doubled haploid (DH) technique. A set of 132 DH lines derived from three European landraces and 106 elite flint (EF) lines were genotyped for 56,110 single nucleotide polymorphism (SNP) markers and evaluated in field trials at five locations in Germany in 2010 for several agronomic traits. In addition, the landraces were compared with synthetic populations produced by intermating DH lines derived from the respective landrace. Our objectives were to (1) evaluate the phenotypic and molecular diversity captured within DH lines derived from European landraces, (2) assess the breeding potential (usefulness) of DH lines derived from landraces to broaden the genetic base of the EF germplasm, and (3) compare the performance of each landrace with the synthetic population produced from the respective DH lines. Large genotypic variances among DH lines derived from landraces allowed the identification of DH lines with grain yields comparable to those of EF lines. Selected DH lines may thus be introgressed into elite germplasm without impairing its yield level. Large genetic distances of the DH lines to the EF lines demonstrated the potential of DH lines derived from landraces to broaden the genetic base of the EF germplasm. The comparison of landraces with their respective synthetic population showed no yield improvement and no reduction of phenotypic diversity. Owing to the low population structure and rapid decrease of linkage disequilibrium within populations of DH lines derived from landraces, these would be an ideal tool for association mapping. Altogether, the DH technology opens new opportunities for characterizing and utilizing the genetic diversity present in gene bank accessions of maize.</p> </div

Mean, genotypic variance (<i>σ²_g</i>), genotype×environment interaction variance (<i>σ²_ge</i>), heritability (<i>h²</i>), predicted gain from selection (<i>ΔG</i>) and usefulness (<i>U</i>) at selection intensity <i>α</i> for agronomic and morphological traits of doubled haploid (DH) lines derived from the landraces <i>Bugard</i> (DH-BU, n = 36), <i>Gelber Badischer</i> (DH-GB, n = 31) and <i>Schindelmeiser</i> (DH-SC, n = 65), as well as of elite flint lines (EF, n = 106).

*, **<p>Significant at the 0.05, 0.01 probability level, respectively.</p>†<p>Different letters indicate significant differences among the four populations for the respective trait.</p>‡<p>1 = absent, 9 = pronounced.</p>§<p>Multiply the reported mean by this this value and the variance components by the square of this this value to obtain the actual numbers.</p

Phenotypic distances among elite flint lines and doubled haploid lines derived from landraces.

<p>Pair-wise Euclidean distances among elite flint (EF) lines and doubled haploid (DH) lines derived from the landraces <i>Bugard</i> (DH-BU), <i>Gelber Badischer</i> (DH-GB), and <i>Schindelmeiser</i> (DH-SC) were calculated from 16 morphological and agronomic traits standardized to mean zero and unit variance.</p

Mean, genotypic variance (<i>σ²_g</i>), genotype×environment interaction variance (<i>σ²_ge</i>), heritability (<i>h²</i>), predicted gain from selection (<i>ΔG</i>) and usefulness (<i>U</i>) at selection intensity α for grain yield and yield components of doubled haploid (DH) lines derived from the landraces <i>Bugard</i> (DH-BU, n = 36), <i>Gelber Badischer</i> (DH-GB, n = 31) and <i>Schindelmeiser</i> (DH-SC, n = 65), as well as of elite flint lines (EF, n = 106).

*, **<p>Significant at the 0.05, 0.01 probability level, respectively.</p>†<p>Different letters indicate significant differences among the four populations for the respective trait.</p>‡<p>at 420 GDD after flowering.</p

Mean performance for agronomic and morphological traits of the landraces <i>Bugard</i>, <i>Gelber Badischer</i> and <i>Schindelmeiser</i>, as well as of the corresponding synthetic populations produced by intermating the respective doubled haploid lines.

†<p>Different letters indicate significant differences among populations for the respective trait.</p>‡<p>1 = absent, 9 = pronounced.</p>§<p>Multiply the reported mean by this value to obtain the actual numbers.</p