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Hyperforin and Myrtucommulone Derivatives Act as Natural Modulators of Wnt/β-Catenin Signaling in HCT116 Colon Cancer Cells
The therapeutic activities of natural plant extracts have been well known for centuries. Many of them, in addition to antiviral and antibiotic effects, turned out to have anti-tumor activities by targeting different signaling pathways. The canonical Wnt pathway represents a major tumorigenic pathway deregulated in numerous tumor entities, including colon cancer. Here, we investigated the acylphloroglucinols hyperforin (HF) from St. John’s wort ( Hypericum perforatum L.) and myrtucommulone A (MC A) from myrtle ( Myrtus communis ) and semi-synthetic derivatives thereof (HM 177, HM 297, HM298) for their effects on Wnt/β-catenin signaling. None of these substances revealed major cytotoxicity on STF293 embryonic kidney and HCT116 colon carcinoma cells at concentrations up to 10 μM. At this concentration, HF and HM 177 showed the strongest effect on cell proliferation, whereas MC A and HM 177 most prominently inhibited anchorage-independent growth of HCT116 cells. Western blot analyses of active β-catenin and β-catenin/TCF reporter gene assays in STF293 cells revealed inhibitory activities of HF, MC A and HM 177. In line with this, the expression of endogenous Wnt target genes, Axin and Sp5, in HCT116 cells was significantly reduced. Our data suggest that the acylphloroglucinols hyperforin, myrtucommulone A and its derivative HM 177 represent potential new therapeutic agents to inhibit Wnt/β-catenin signaling in colon cancer
Structural and functional characterization of the AAA+ ATPases Pontin and Reptin
Pontin und Reptin sind die beiden einzigen Vertreter der hochkonservierten
Tip49-Subfamilie der AAA+-ATPasen in Eukaryoten. Sie zeichnen sich durch ihre
besondere Domänenstruktur und ihre essentielle Beteiligung an einer Vielzahl
biologischer Prozesse aus. So sind Pontin und Reptin an der Assemblierung von
snoRNPs und der Telomerase beteiligt. Zusätzlich sind beide Proteine
essentielle Bestandteile verschiedener Chromatin-Remodelling-Komplexe. Durch
die Regulation der Transkription verschiedener potentiell onkogener Faktoren,
wie beta-Catenin und c-Myc, sind Pontin und Reptin entscheidend an Prozessen
der humanen Kanzerogenese beteiligt. In dieser Arbeit wurde das
Tumorsuppressorprotein Fhit als neuer direkter Interaktionspartner von Pontin
und Reptin identifiziert. Dabei konnte die Bindung von Fhit im Bereich der
Aminosäuren 67-148 von Pontin und 1-147 von Reptin kartiert werden. Diese
Bereiche binden keine bisher bekannten direkten Interaktionspartner von Pontin
und Reptin, wie zum Beispiel beta-Catenin, Hint1 oder c-Myc. Die Analysen der
Effekte von Pontin oder Reptin und Fhit auf beta-Catenin-aktivierbare
Reportergene zeigten, dass Pontin die reprimierende Wirkung von Fhit
einschränkte, Reptin diese jedoch verstärkte. Durch konfokale
Immunfluoreszenzmikroskopie konnte eine Co-Lokalisation von Pontin, Reptin und
Fhit im Nukleus verschiedener Zelllinien nachgewiesen werden. Durch ChIP und
Re-ChIP Analysen konnte die Bildung gemeinsamer Komplexe von Pontin, Reptin
oder beta-Catenin und Fhit an Promotorbereiche der Wnt-Zielgene CyclinD1 und
MMP-14 nachgewiesen werden. Da diese Befunde eine Beteiligung von Fhit an
Prozessen des Chromatin-Remodelling nahe legten, wurde mit Hilfe von
Immunpräzipitationen nachgewiesen, dass Fhit, Pontin und Reptin in gemeinsamen
Komplexen mit der Histon-Aceytltransferase Tip60 vorliegen. Weitere
Interaktionsassays mit gereinigten, rekombinanten Proteinen zeigten, dass Fhit
und Tip60 direkt miteinander interagieren. Diese Befunde deuten auf eine neue
Funktion von Fhit im Tip60-Chromatin-Remodelling-Komplex hin. Bei den
immunfluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen zur intrazellulären
Lokalisation von Pontin konnte neben der nukleären auch eine punktuelle
Färbung im Nukleolus nachgewiesen werden. Bei der weiteren Untersuchung dieser
Befunde konnte für Pontin gezeigt werden, dass es Zellzyklus-abhängig im
Nukleolus akkumuliert, dort in gemeinsamen Komplexen mit RNA-Polymerase I in
den fibrillären Zentren vorliegt und zusammen mit c-Myc an regulatorische
Elemente der chromosomalen DNA in den rRNA-Gen-Clustern bindet. Die Befunde
deuten darauf hin, dass Pontin als wichtiger Co-Aktivator von c-Myc und RNA-
Polymerase I an der Regulation der rRNA-Synthese beteiligt ist.Pontin and Reptin are the two only representatives of the Tip49 subfamily of
AAA+-ATPases in eukaryotes. They are characterized by their unique domain
structure and by their essential participation in a multitude of biological
processes. Pontin and Reptin participate in the assembly of snoRNPs and
telomerase. In addition, they are both essential components of several
chromatin-remodelling-complexes. Through their regulation of different
oncogenic factors like beta-Catenin und c-Myc, Pontin and Reptin are
critically involved in processes of human cancerogenesis. In this thesis the
tumour suppressor protein Fhit was identified as a novel direct interaction
partner of Pontin and Reptin. The binding site of Fhit in Pontin and Reptin
was mapped to amino acids 67-148 and 1-147, respectively. These sequences are
not bound by any known interaction partner like beta-Catenin, Hint1 or c-Myc.
Pontin or Reptin and Fhit affect b-catenin/LEF-1/TCF4-mediated- reporter gene
activity. Pontin reduced the repressive effects of Fhit, whereas Reptin
potentiated them. Imaging with confocal-immunofluorescence microscopy revealed
a co-localisation of Pontin or Reptin and Fhit in the nucleus of different
cell lines. ChIP and Re-ChIP experiments revealed common complexes of Fhit and
Pontin, Reptin or beta-Catenin bound to promoter elements of the known Wnt
target genes Cyclin D1 and MMP-14. Since these findings pointed to an
involvement of Fhit in chromatin-remodelling processes, co-immunprecipitation
experiments were performed showing that Fhit, Pontin and Reptin form a complex
with the histone-acetyltransferase Tip60. In pull-down experiments with
recombinant proteins a direct interaction between Fhit and Tip60 was detected.
These discoveries suggest a new function of Fhit in chromatin-remodelling
complexes. Using monoclonal antibodies developed in our laboratory, Pontin was
detected in dot like structures in the nucleolus in immunfluorescence
microscopy. More detailed investigations revealed that Pontin accumulates in a
cell-cycle dependent manner in the nucleolus, where it forms complexes with
RNA-Polymerase I in the fibrillar centers and binds to regulatory elements in
the chromosomal DNA of rRNA-gene clusters in combination with c-Myc. Since
nucleoli with strong Pontin staining showed a clear reduction of newly
synthesized RNA it is reasonable to assume that Pontin is a positive regulator
of rRNA transcription and that sequestration of Pontin to transcriptionally
inactive fibrillar centers might represent a regulatory mechanism of rRNA
transcription during the cell cycle