Functional effects of the genetic manipulation of the phosphorylation state of the Target of Rapamycin effector Npr1

[EN] The plasma membrane of eukaryotic cells is under constant remodelation of its receptor and transport proteins due to the changing needs of the cell to maintain its viability and for adapting to its environment. The flux of amino acids and other nutritional compounds transported into the cell depends on membrane protein transporters known as permeases. Opposing and parallel mechanisms of endocytosis of existing permeases and delivery of new ones determine the amount and collection of permeases present in the cell at any given time. The endocytosis and subsequent degradation of these permeases is regulated by post-translational modifications in which ubiquitination plays a fundamental role. The TORC1 kinase complex (Target Of Rapamycin) acts as a signal transducer for ubiquitin-mediated endocytosis, among other functions. Rsp5 is a HECT family E3 ubiquitin-ligase in S. cerevisiae which is responsible for the ubiquitination of the majority of nutrient and amino acid permeases. The interaction is done via adaptor proteins, many of which belong to the ART family (arrestin related trafficking adaptors). These adaptors determine the Rsp5 specificity for the membrane permeases. Npr1 kinase is one of the targets of phosphorylation of TORC1 and has been identified as the effector kinase responsible for the signal transduction to the ARTs. Npr1 phosphorylation of Art1 directly results in the inhibition of Rsp5-mediated endocytosis of permeases. Art3 has also been described as a substrate for Npr1. Our recent preliminary data shows that Npr1 binds physically to Art3. However, the role of Npr1 in Art3 regulation is still unclear. This project aims to observe the functional effects of the state of phosphorylation of Npr1. For that purpose, the Npr1 hypophosphorylation and hyperphosphorylation states have been artificially recreated by chemical treatments (rapamycin) or by genetic manipulation, using mutants of different phosphatases and kinases implied. Employing this experimental set-up, we will determine whether a correlation exists between the Npr1 phospho-state and three different outputs: 1) Npr1 binding to the Art3 alpha-arrestin, 2) the subcellular localization of Npr1 itself and 3) the subcellular localization of membrane permeases.[CA] El comportament dels microorganismes està basat en optimitzar el seu creixement i maximitzar la seua supervivència. Estes cèl•lules tenen la capacitat d’avaluar la quantitat i qualitat de nutrients disponibles i d’ajustar consegüentment els seus perfils transcripcionals, metabòlics i de desenvolupament per proporcionar el conjunt apropiat de les proteïnes responsables del consum, transport i processament dels nutrients. La ruta de senyalització TORC1 (Target Of Rapamycin Complex 1), o complex diana de la rapamicina, és un controlador central del creixement cel•lular i és en gran part responsable de la coordinació de la resposta cel•lular als canvis en la font i la disponibilitat del nitrogen. El flux d’aminoàcids i altres compostos nitrogenats transportats cap a l’interior cel•lular depèn d’uns transportadors de membrana anomenats permeases. Els mecanismes oposats i en paral•lel d’endocitosis de permeases existents i el lliurament de noves determinen la quantitat i diversitat d’estes proteïnes a la membrana plasmàtica en cada moment. L’endocitosi i subsegüent degradació d’estes permeases és regulat per modificacions post-traduccionals, on la ubiquitinació juga un paper fonamental. Rsp5 és una E3 ubiquitina ligasa de S. cerevisiae de la família HECT responsable de la ubiquitinació de la majoria de les permeases dels nutrients i aminoàcids. La interacció es dóna via proteïnes adaptadores, on moltes de les quals pertanyen a la família ART (arrestin-related trafficking) o proteïnes adaptadores de tràfic relacionades amb arrestina. Estos adaptadors determinen l’especificitat de Rsp5 per les permeases de membrana. Npr1 és una de les dianes de fosforilació de TORC1 i promou l’activitat de diversos sistemes de transport de nutrients nitrogenats. S’ha identificat com la quinasa efectora de TORC1 és responsable de la transducció del senyal a les ARTs. Específicament, s’ha demostrat que Npr1 fosfoinhibeix directament a Art1, el qual resulta en la inhibició de l’endocitosi de permeases mediada per Rsp5. A més, Npr1 també és capaç d’unir-se i fosforilar Art3, encara que les conseqüències d’aquesta regulació encara no s’han establert. L’activitat de Npr1 es regula a través del seu estat de fosforilació, estant actiu quan es troba desfosforilat i inactiu quan es troba fosforilat. En aquest projecte s’ha intentat arribar més lluny en l’exploració d’este particular mecanisme depenent de TORC1 d’ubiquitinació mediada per les ARTs i de la subsegüent endocitosi de transportadors de nutrients fent la hipòtesi on l’estat de fosforilació de Npr1 es correlaciona amb la seua funcionalitat en el context d’aquest procés. La hipòtesi va ser explorada utilitzant diferents plantejaments experimentals per a analitzar un conjunt de cepes mutants en les quals s’havia descrit un efecte permanent en l’estat de fosforilació de Npr1.Albiñana Climent, C. (2016). Functional effects of the genetic manipulation of the phosphorylation state of the Target of Rapamycin effector Npr1. http://hdl.handle.net/10251/68618.TFG