雄マウス超音波音声による雌の繁殖機能促進メカニズムの解明

【総合緒言】　動物の繁殖は、適切な交配相手を見つけ、認知し、求愛することによって始まり、その際に、雄と雌は様々な感覚を利用してコミュニケーションをとりあう。その一つである音声による雌雄間コミュニケーションは、これまで鳥類やシカなどで詳しく調べられており、雄の鳴き声には雌を誘引する効果があるだけでなく、排卵を促進するといった繁殖機能を活性化する効果があることも報告されている。　雄マウスも雌に出会うと、ヒトには聞こえない超音波領域で鳥類のさえずりのような歌（Ultrasonic vocalizations; USVs）を発する。マウスのUSVs研究の多くは、様々な発達過程や環境下、系統や疾患モデルにおける発声パターンの解析に焦点が当てられてきた。しかしながら、雌マウスにおけるUSVsの受容と伝達に関わる神経回路と繁殖制御機構に対する効果については未だ不明な点が多い。博士前期課程の研究では、雌は自身とは異系統の雄のUSVsへ嗜好性を示し、子孫の遺伝的多様性をもたらす配偶者選択に寄与することを示唆してきた。また、雌のUSVsへの嗜好性は雄の床敷や雄フェロモンが存在している際に顕著に現れることを明らかにしている。このことから、雌は雄が発する聴覚シグナルと嗅覚シグナルを脳内で統合することで、適切なUSVsへの嗜好性を示す可能性が考えられた。そこで、本研究の第1章では、雄のUSVsが雌の接近行動に対して効果を示すための聴覚シグナルと嗅覚シグナルの統合機構を明らかにすることを目的として、USVsとフェロモンの共提示により活性化する脳部位の同定を目指した。　雄のUSVsが雌の繁殖機能を促進させるかについては、博士前期過程の研究で、USVsを多く発声する雄とペアになった雌は出産回数が増えることを明らかにしている。このことから、雌が雄のUSVsを受容することで繁殖制御中枢が活性化し、交尾行動や排卵の促進によって繁殖効率が向上するメカニズムの存在が考えられた。しかし、USVsがどのように雌の繁殖制御機構に作用しているのかは明らかになっていない。そこで、第2章では、雌性ホルモンであるエストラジオールと、生殖内分泌中枢を司るキスペプチンニューロンに着目し、雄のUSVsの提示によりその活性レベルが高まるかを調査した。【第１章　雄の超音波音声とフェロモンの統合神経核の同定】　実験1では、雌の性的覚醒を高めることが報告されている雄フェロモンであるExocrine gland-secreting peptide 1 (ESP1) (Haga et al., 2010) と雄のUSVs、あるいはESP1とバックグラウンドノイズ (Noise) を提示されたC57BL/6J (B6)系統の雌の神経活動を比較した。再生音には、B6系統の雄のUSVsよりも嗜好性を示すことが明らかになっているBALB/c系統の雄のUSVsを用いた。活性化した神経細胞の脳内局在は、c-fosのmRNA発現を指標に、in situ ハイブリダイゼーション法を用いて全脳領域で解析した。その結果、内側前頭前皮質 (mPFC) において、ESP1とUSVsを共提示した群は、ESP1とNoiseを提示した群に比べてc-fos陽性反応の顕著な上昇が見られた。また、一次聴覚野 (Au1) の2-4層、視床下部の腹内側部背内側核 (VMHdm)、扁桃体基底核 (BLA) においてもESP1とUSVsを共提示した群ではc-fos陽性反応が有意に高かった。　実験2では、複数の刺激に由来する情報を統合する領域だと考えられており、実験1で雄のESP1とUSVsの共提示により高い神経活性があることが検出されたmPFCの前辺縁皮質 (PrL) と下辺縁皮質 (IL) に着目して、その神経活性と雌の行動との関連を調査した。その結果、ESP1とUSVsを共提示した群では、対照群である溶媒 (Tris) とNoiseを共提示した群やESP1とNoiseを共提示した群に比べて、PrLのc-fosタンパク質の発現が有意に多く観察された。再生音提示中の行動と相関分析を行った結果、PrLのc-fos陽性細胞数と再生開始から5分間のスピーカー探査行動の持続時間には、正の相関が認められた。　実験3では、二重免疫組織化学的手法を用いてESP1とUSVsにより活性化した神経細胞の特性を調べた。皮質における神経細胞は、使用している神経伝達物質によって抑制性ニューロンと興奮性ニューロンに大きく分類され、抑制性ニューロンはGABA (γ-aminobutyric acid: ガンマ-アミノ酪酸) を、興奮性ニューロンはグルタミン酸を伝達物質として使用している。そこで、GABA作動性ニューロンならびにグルタミン酸作動性ニューロンに着目して解析を行った。その結果、c-fos陽性細胞の多くが、GABA陽性細胞よりも、グルタミン酸作動性ニューロンのマーカーとして用いたGLS2 (Phosphate activated glutaminase 2) 陽性細胞と重なっていた。このことから、USVsとESP1の複合的な刺激によりPrLで活性化する神経細胞の多くが興奮性のグルタミン酸ニューロンであり、情報を他の領域へ伝達し、USVsに対する接近行動を制御している可能性が示された。【第２章　雄のUSVsが雌の生殖内分泌へ及ぼす効果の調査】　超音波スピーカーによる雄のUSVsの提示により、雌の生殖内分泌中枢が活性化されるかを末梢（実験4）、中枢（実験5）、神経細胞（実験6）単位で調査した。実験4 では、末梢に蓄積されたエストラジオール値を反映している糞中のエストラジオール値が雄のUSVsによって上昇するかを調べた。齧歯類の糞中のエストラジオール値は、雌の性成熟や性周期に応じて変化することが認められている（Chelini et al., 2005）。本実験では、非発情期の雌、発情期の雌、発情前期の雌、卵巣を除去した雌にNoiseまたはUSVsを提示し、その後、排泄した糞中のエストラジオール濃度を測定した。しかし、Noise提示群とUSVs提示群の間で、糞中エストラジオール濃度に明瞭な差は見られなかった。　実験５では、非発情期の雌と発情前期の雌に、NoiseまたはUSVsを提示し、その後、視床下部と聴覚野のエストラジオール濃度を測定した。鳥類では、雄の歌によって視床下部や聴覚野のエストラジオール値が上昇することが報告されている (Maney and Pinaud, 2011)。しかし、マウスを用いた本実験では、どちらの領域においてもNoise提示群とUSVs提示群の間で、エストラジオール濃度に明瞭な差は見られなかった。実験１では、雌に雄のUSVsとフェロモンを共提示することによって、聴覚野や視床下部の一部により高い神経活性が起こることを見出している。マウスの場合、USVsのみの刺激ではなく、雄の聴覚シグナルと嗅覚シグナルの複合的な刺激を受けることが、これらの脳部位の活性を効果的に高めるために必要であると考えられた。　そこで、実験６では、雄の嗅覚シグナルとの共提示の影響を加味し、視床下部の神経細胞に着目して解析を試みた。性腺刺激ホルモン放出ホルモン (GnRH) のサージ状分泌を制御し、また排卵の誘発に関与する前腹側周囲核 (AVPV) におけるキスペプチンニューロンと、GnRHのパルス状分泌とFSH分泌を制御し、また卵胞発育に関与する弓状核 (Arc) におけるキスペプチンニューロンの活性を、リン酸化cAMP応答配列結合タンパク (pCREB) を指標に二重免疫組織化学的手法により観察した。その結果、AVPVにおける活性化キスペプチン陽性細胞の割合は、提示した刺激の違いによる差が認められなかった。一方、Arcを背側部 (ArcD) と外側部 (Arc L) の2領域に分けて解析した結果、ArcLにおける活性化キスペプチン陽性細胞の割合は、提示した刺激によって差があった。ArcLではpCREB陽性細胞数とキスペプチン陽性細胞数に違いはなかったが、USVsを提示したTris + USVs 群とESP1 + USVs群は、Tris + Noise群に比べて活性化キスペプチン陽性細胞の割合が高い傾向が見られた。これらの結果から、雄のUSVsはArcにおけるキスペプチンニューロンに作用していることが示唆された。【総合考察】　本研究の解析から、雄のUSVsとESP1の共提示により雌のPrLの神経がより活性化することが明らかになった。PrLは感覚統合や意思決定に関連していることが報告されていることから、雌は雄の聴覚情報と嗅覚情報をこの部位で統合し、適切な雄への嗜好性や接近行動を示すことを見出した。加えて、USVsはArcにおけるキスペプチンニューロンに作用し、卵胞発育を促進する可能性も示した。本研究は、雄のUSVsがフェロモンと共に雌の感覚統合機構に作用して適応的な繁殖行動を誘発するという雌雄間コミュニケーションの新たなメカニズムを明らかにし、さらに雄のUSVsが雌の繁殖内分泌中枢を活性化することで、繁殖機能促進に寄与していることを示唆した。Male-female interaction is important for selecting a suitable mating partner and for ensuring reproductive success. It was suggested that male sexual signals such as vocalizations are attractive to females in many animals. Male mice emit song-like “ultrasonic vocalizations (USVs)”, when they encounter female or female’s urinary pheromones. The characteristics of male USVs differ among inbred strains (Panksepp et al., 2007; Kikusui et al., 2011; Sugimoto et al., 2011), and their USV profiles are suggested to be regulated genetically. On the other hand, the biological significance of these repertoires of USVs has not been identified. To demonstrate that female mice could discriminate different male USVs, we recently conducted playback experiments to assess the responses of female mice to USVs of male mice from various strains. We found that inbred female mice could discriminate the characteristics of USVs, and that they preferred the USVs of mice that were from different strains than their own strains. It was suggested that this preference of females for USVs of males from a different strain contributes to disassortative mating, which is an important mate choice strategy for avoiding inbreeding and facilitating the heterozygosity of offspring. In addition, we also found that the preference of females for USVs from a different strain was only observed when females were concomitantly exposed to the male pheromone, “Exocrine grand-secreting peptide 1 (ESP1)” (Asaba et al., 2014). This implies that the preference for male USVs is governed by the multisensory integration of both acoustic and olfactory signals. In Chapter 1, to understand the underlying neural mechanism, we searched the nuclei that were activated when exposed to both male USVs and pheromone in female mice.　　Male vocalizations are not only attracting to females but could also promote female fertility in some animals. However, it had not been studied intensively in mice USVs. We recently investigated the relationship between the numbers of delivery in breeding pairs for 4 months and numbers of USVs syllables emitted from males of those pairs during 3 minutes of sexual encounter with unfamiliar females. Interestingly, there was a positive correlation between these two indices, suggesting a possibility that male USVs could promote female’s fertility. We also examined the effect of male USVs on sexual behavior in females, and found that females approached towards vocalizing-males more frequently as compared to devocalized-males. In Chapter 2, to understand how male USVs activate reproductive function in females, we examined whether male USVs could increase estradiol level and activate Kisspeptin neurons, key neurons to regulate reproductive function in the hypothalamus.Chapter 1: Multisensory integration of male USVs and pheromone in female mice　　In experiment 1, we analyzed the c-fos expression pattern by in situ hybridization in the whole brain areas of female mice when exposed to male USVs generated by the ultrasound speakers after ESP1 exposure. The results demonstrated that the higher expression of c-fos mRNA was observed in the medial prefrontal cortex (mPFC) when females were exposed to “ESP1 and USVs” with compared to “ESP1 and noise” as control. This area has been identified as a key region for multisensory integration and decision-making. Additionally, a higher expression of c-fos mRNA was also observed in the primary auditory cortex (Au1), the ventromedial hypothalamic nucleus dorsomedial part (VMHdm), and the basolateral amygdaloid nucleus (BLA).　　In experiment 2, we focused on the mPFC and analyzed the relationship between its neural activity using immunocytochemistry and behaviors. Females were exposed to either male USVs or noise control combination with either ESP1 or Tris-HCL (vehicle for ESP1) exposure. Compared with exposure of “Tris and noise”, the larger number of c-fos-immunoreactive (IR) cells in the prelimbic region (PrL) of the mPFC and longer time in searching behavior to the speaker were observed in females exposed to “ESP1 and USVs”. In addition, there was a positive correlation between these 2 matters, suggesting that females exposed to the USVs had a larger number of c-fos-IR cells in the PrL and a longer time searching.　　In experiment 3, to examine characteristic of neurons in the PrL that were activated by “ESP1 and USVs”, we conducted dual-label immunocytochemistry with c-fos and either GABAgenic or glutamatergic neuronal marker. As a glutamatergic neuronal marker, GLS2 (phosphate activated glutaminase 2) was used. As results, most of c-fos-IR cells in the PrL also expressed GLS2, indicating that the neurons activated by ESP1 and USVs are excitatory glutamatergic neurons. It is suggested that these neurons transmit neural signals to another region and regulate approaching behavior to male USVs.Chapter 2: Effect of male USVs to reproductive neuroendocrine system in female mice　　In experiment 4, we measured estradiol concentration in the feces when exposed to male USVs or noise control by enzyme immunoassays. It has suggested that the fecal estradiol concentration reflects peripheral estradiol level (Chelini et al., 2005). However, there was no significant difference in the fecal estradiol concentration between the groups. 　　In experiment 5, we focused on estradiol in brain and measured estradiol concentration in the hypothalamus and auditory cortex. Previous studies have revealed that the estradiol level in this brain area is increased by exposure of male vocalization in birds (Maney and Pinaud, 2011). However, there was no significant difference in the estradiol concentration between USVs exposure group and noise exposure group in these areas.　　In experiment 6, the activation of kisspeptin neurons were examined using dual-label immunocytochemistry with cAMP response element-binding protein phosphorylation (pCREB) in females exposed to “Tris and noise”, “ESP1 and noise”, “Tris and USVs”, and “ESP1 and USVs”. We focused on two distinctive populations of kisspeptin neurons located in the anteroventral periventricular nucleus (AVPV) and the acuate nucleus (Arc) in the hypothalamus. In the AVPV, there was no significant difference in the rate of kisspeptin neurons expressing pCREB between the groups. On the other hand, in the Arc, the rate of kisspeptin neurons expressing pCREB significantly increased in both “Tris and USVs” and “ESP1 and USVs” exposure groups as compared with “Tris and noise”. Kisspeptin neurons in the Arc have known to be the proximate source of the GnRH pulse secretion that is essential for basal FSH secretion, thereby promoting follicular development. This results suggest that male USVs could increase female fertility by activating the kisspeptin neurons in the Arc.　　In conclusion, we discovered that higher neural activity was evoked in the PrL of mPFC when female mice were exposed to both male pheromone and USVs. We suggest that the preference for male USVs is induced by multisensory integration with pheromonal cue in PrL. Additionally, our results suggest that male USVs activate kisspeptin neurons in the Arc, implying that male USVs contribute to follicular development in female mice. The present study uncovers new possibilities for studying the molecular and neural mechanisms of multisensory integration, and contributes to reveal the mechanism for enhancing female reproductive function by male signals in animals.博士(学術)麻布大

Developmental Social Environment Imprints Female Preference for Male Song in Mice

<div><p>Background</p><p>Sexual imprinting is important for kin recognition and for promoting outbreeding, and has been a driving force for evolution; however, little is known about sexual imprinting by auditory cues in mammals. Male mice emit song-like ultrasonic vocalizations that possess strain-specific characteristics.</p><p>Objectives</p><p>In this study, we asked whether female mice imprint and prefer specific characteristics in male songs.</p><p>Methods and Findings</p><p>We used the two-choice test to determine the song preference of female C57BL/6 and BALB/c mice. By assessing the time engaged in searching behavior towards songs played back to females, we found that female mice displayed an innate preference for the songs of males from different strains. Moreover, this song preference was regulated by female reproductive status and by male sexual cues such as the pheromone ESP1. Finally, we revealed that this preference was reversed by cross-fostering and disappeared under fatherless conditions, indicating that the behavior was learned by exposure to the father's song.</p><p>Conclusions</p><p>Our results suggest that female mice can discriminate among male song characteristics and prefer songs of mice from strains that are different from their parents, and that these preferences are based on their early social experiences. This is the first study in mammals to demonstrate that male songs contribute to kin recognition and mate choice by females, thus helping to avoid inbreeding and to facilitate offspring heterozygosity.</p></div

Female mice prefer songs of males from different strains.

<p>(<b>a</b>) Schematic of the apparatus used for the playback experiment. (<b>b</b>) B6 (<i>n</i> = 6) and BALB (<i>n</i> = 10) females in diestrus exposed to male-soiled bedding before testing showed longer-duration search times for other strains' songs. (<b>c</b>) Duration of time searching during diestrus in B6 (<i>n</i> = 5) and BALB (<i>n</i> = 7) females in the absence of male odor before testing. (<b>d</b>) B6 (<i>n</i> = 11) and BALB (<i>n</i> = 13) females in diestrus exposed to male pheromone ESP1 before testing showed longer duration search times for other strains' songs. Values represent means+standard error. Asterisks indicate significant differences p<0.05.</p

Female song searching response to playback with KJR and ICR strain male song.

<p>(<b>a</b>) When B6 and ICR male songs were presented, ESP1-treated B6 females showed longer search times for ICR songs than for B6 songs (<i>n</i> = 13), whereas there was no difference in search time when B6 and KJR male songs were presented (<i>n</i> = 12). (<b>b</b>) When BALB and KJR male songs were presented, ESP1-treated BALB females showed longer search times for KJR songs than for BALB songs (<i>n</i> = 12), whereas there was no difference when BALB and ICR male songs were presented (<i>n</i> = 11). Values represent means+standard error. Asterisks indicate significant differences p<0.05.</p