Signs and Symptoms of Temporomandibular Joint Disorders Related to the Degree of Mouth Opening and Hearing Loss

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>The temporomandibular joint is a unique bi-condylar joint involved in mastication and speech. Temporomandibular joint disorders (TMD) have a range of symptoms, including aural symptoms, and are present in approximately 75% of normal populations. The present study examined the relationship between signs and symptoms of TMD and mouth opening, gender, joint and aural symptoms, and hearing loss.</p> <p>Methods</p> <p>The study involved 464 healthy Greek university students (156 men and 308 women) with a mean age of 19.6 years. Age, gender and maximum mouth opening was recorded. Mouth opening was measured using Vernier calipers. An anamnestic questionnaire was used to stratify the subjects into four groups based on TMD severity. Aural symptoms and an audiogram were recorded for each subject too. Data were analyzed using multifactor ANOVA, chi-square, t-test, Mann-Whitney and Kruskal-Wallis tests.</p> <p>Results</p> <p>The overall incidence of TMD signs and symptoms was 73.3%. The incidence and severity was greater in females than males (p-value 0.0001 < 0.05). The number of aural symptoms was associated to the TMD severity (p-value 0.0001 < 0.05) as well as maximum mouth opening (p-value 0.004 < 0.05). Audiometry showed that moderate and severe TMD was associated with hearing loss of median and low tones respectively (p-value 0.0001 < 0.05). TMJ pain (p-value 0.0001 < 0.05), TMJ ankylosis (p-value 0.0001 < 0.05), bruxism (p-value 0.0001 < 0.05) and ear itching (p-value 0.0001 < 0.05) were also found to be statistically different between TMD and non-TMD subjects.</p> <p>Conclusions</p> <p>TMD signs and symptoms were more common and severe in females than males. TMD severity is correlated with the degree of mouth opening and the number of aural symptoms. The absence or presence of mild TMD are associated with normal audiograms while moderate and severe TMD are related to hearing loss in median and low tones respectively. Bruxism, joint ankylosis, joint pain and ear itching were more common in TMD than non-TMD patients.</p

Clinical study of the factors affecting radioulnar deviation of the wrist joint

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>The radioulnar carpal joint is critical for hand and wrist function. Radioulnar deviation indicates distal radioulnar joint flexibility and reflects the structure and function of the carpal bones, ulna, radius and ligaments. The present study examined whether radioulnar deviation is affected by gender, manual labor, playing a musical instrument, playing sport, handedness, previous fracture or prior inflammation. The study used clinical findings based on anatomical landmarks</p> <p>Methods</p> <p>The ulnar, radial and total deviations for both left and right hands were measured in 300 subjects (157 men and 143 women) of mean age 21.7 years. Measurements were made with the forearm in a fixed pronated position using a novel specially designed goniometer. The gender of each subject was recorded, and information on playing of sport, playing a musical instrument, manual labor, handedness, and history of fracture or inflammation was sought. Data were analyzed using a multifactor ANOVA test.</p> <p>Results</p> <p>No statistically significant difference (p-value > 0.05) was found between those comparing groups except the total deviation of athletes' left hand versus the total deviation of non athletes' left hand (p-value 0.041 < 0.05) and the radial deviation of manual workers' left hand and non manual workers' left hand (p-value 0.002 < 0.05).</p> <p>Conclusions</p> <p>This study was based on clinical findings using anatomical landmarks. We found that manual workers and athletes showed greater left hand flexibility. This suggests that activities that place chronic stress on the radiocarpal joint can independently affect radioulnar deviation.</p

Metabolome wide association studies using genetic variants linked to colorectal cancer, multiple myeloma and blood pressure

Τα τελευταία χρόνια οι μελέτες συσχέτισης ολικού γονιδιώματος (GWAS) έχουν εντοπίσει μια πληθώρα γενετικών πολυμορφισμών που σχετίζονται με πολύπλοκες ασθένειες. Για έναν μικρό αριθμό γενετικών πολυμορφισμών, οι μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους αυτοί συνδέονται με τη σχετιζόμενη ασθένεια είναι γνωστοί. Ωστόσο, για τη συντριπτική πλειοψηφία αυτών παραμένουν σε μεγάλο βαθμό ανεξερεύνητοι. Επιπλέον, τα μεγέθη επίδρασης των γενετικών συσχετίσεων με ασθένειες είναι γενικά μικρά και απαιτούν κοόρτες με πολύ μεγάλο μέγεθος πληθυσμού. Για τους λόγους αυτούς, τα ευρήματα των GWAS δεν έχουν οδηγήσει σε σημαντικές βελτιώσεις στην κλινική διαχείριση των σχετιζόμενων νόσων. Οι κλασικές GWAS μελέτες έχουν επεκταθεί σε μελέτες συσχέτισης με ενδιάμεσα χαρακτηριστικά, όπως η έκφραση RNA ή μεταβολίτες που είναι γνωστοί παράγοντες κινδύνου της εξεταζόμενης νόσου (όπως τα επίπεδα τριγλυκεριδίων ή γλυκόζης). Τα χαρακτηριστικά αυτά εμφανίζουν μεγαλύτερα μεγέθη επίδρασης καθώς βρίσκονται πιο κοντά στο κλινικό αποτέλεσμα σε σύγκριση με τον γονότυπο. Την τελευταία δεκαετία, η μεταβολομική έχει αναδυθεί ως ένα ισχυρό εργαλείο για την ενδελεχή μέτρηση των μεταβολιτών, δηλαδή μορίων χαμηλού μοριακού βάρους, στα βιολογικά υγρά, επιτρέποντας την ταυτόχρονη ανίχνευση και ποσοτικοποίηση μιας ποικιλίας μικρών μορίων με διαφορετικές χημικές ιδιότητες και δομές. Μια άλλη σημαντική πτυχή της μεταβολομικής είναι ότι το μεταβόλωμα αντανακλά την επίδραση τόσο των ενδογενών όσο και των εξωγενών εκθέσεων. Ως εκ τούτου, επιτρέπει τη διερεύνηση τόσο των γενετικών όσο και των περιβαλλοντικών επιπτώσεων στον κλινικό φαινότυπο. Πρόσφατες μελέτες έχουν διερευνήσει τη συσχέτιση δεδομένων GWAS με δεδομένα μεταβολομικής, γνωστές ως μελέτες συσχέτισης ολικού γονιδιώματος με συγκεντρώσεις μεταβολιτών (mGWAS). Σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να εφαρμόσει μια στρατηγική ανάλυσης συσχέτισης ολικού μεταβολώματος (ΜWAS) με γενετικές παραλλαγές που έχουν προηγουμένως συσχετισθεί με μια συγκεκριμένη σύνθετη ασθένεια, όπως διάφοροι τύποι καρκίνου και καρδιαγγειακές νόσοι, προκειμένου να διερευνηθούν διεξοδικά οι αλληλεπιδράσεις γονιδίων-μεταβολιτών και να αποκαλυφθούν υποκείμενες μεταβολικοί οδοί της νόσου στο αγνωστικιστικό πλαίσιο των GWAS μελετών. Εξετάσθηκε η συσχέτιση γενετικών παραλλαγών που έχουν προηγουμένως συνδεθεί με τρεις σύνθετες ασθένειες, καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC), πολλαπλό μυέλωμα (MM) και υψηλή αρτηριακή πίεση (BP), με μεταβολίτες ως ενδιάμεσα χαρακτηριστικά, εφαρμόζοντάς μια μεταβολομική προσέγγιση μέσω φασματοσκοπίας Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (NMR) σε μια μεγάλη ομάδα πληθυσμού του Ηνωμένου Βασιλείου. Πιο συγκεκριμένα, αναλύθηκαν τα δεδομένα GWAS, καθώς και τα δεδομένα NMR ούρων και αίματος από 1,974 συμμετέχοντες στη Μελέτη Παρακολούθησης Της Υγείας των Ραδιοκυμάτων (ΑΙRWAVE). Αρχικά πραγματοποιήθηκε ανάπτυξη μεθοδολογίας, τονίζοντας την ανάγκη για ταυτόχρονη εφαρμογή τόσο στοχοθετημένων όσο και μη στοχευμένων προσεγγίσεων μεταβολομικής. Εξετάστηκε επίσης η χρήση πολυμεταβλητών προσεγγίσεων, η οποία δεν έχει ακόμη διερευνηθεί και καθιερωθεί σε αυτού του είδους τις μελέτες. Η χρήση των πολυμεταβλητών προσεγγίσεων είναι υψηλής σημασίας προκειμένου να ληφθούν υπόψη οι δομές εξάρτησης στα δεδομένα omics. Ένα άλλο πλεονέκτημα αυτής της μελέτης είναι η ταυτόχρονη ανάλυση δειγμάτων πλάσματος και ούρων, καθώς το μεταβόλωμα των ούρων παραμένει σε μεγάλο βαθμό ανεξερεύνητο στο πλαίσιο των GWAS. Πραγματοποιήσαμε απόδοση κορυφών και ταυτοποίηση των μεταβολιτών στα φάσματα NMR των ούρων για την AIRWAVE, χρησιμοποιώντας πειράματα 2D NMR, στατιστικές προσεγγίσεις (π.χ. στατιστική φασματοσκοπία συνολικής συσχέτισης-STOCSY), καθώς και πειράματα εμβολιασμού δειγμάτων με πρότυπες ουσίες. Με βάση την ανάπτυξη μεθοδολογίας, για κάθε γενετικό πολυμορφισμό πραγματοποιήθηκε ανάλυση μερικής συσχέτισης Spearman των δεδομένων NMR. Όλες οι μονομεταβλητές αναλύσεις προσαρμόστηκαν για συγχυτικούς παράγοντες (confounders) και διορθώθηκαν για 5% Ποσοστό Ψευδών Ανακαλύψεων (False Discovery Rate) (μη στοχευμένη προσέγγιση) ή στο 5% Bonferroni (στοχευμένη προσέγγιση). Χρησιμοποιήσαμε επίσης τους λόγους των μεταβολιτών, οι οποίοι έχει βρεθεί ότι αυξάνουν τη συσχέτιση για ένα ζεύγος προϊόντος-υποστρώματος. Χρησιμοποιήθηκαν επίσης πολυμεταβλητές προσεγγίσεις, όπως η ανακάλυψη γνώσης με μεγιστοποίηση της ακρίβειας (KODAMA) και η σποραδική παλινδρόμηση μερικών ελάχιστων τετραγώνων (SPLS) προκειμένου να διερευνηθεί η σχέση των γενετικών πολυμορφισμών και των μεταβολικών χαρακτηριστικών σε ένα πολυμεταβλητό πλαίσιο. Για την ανάλυση του CRC και της BP, όπου είναι γνωστό ότι οι περιβαλλοντικοί παράγοντες διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην παθογένεση των νόσων αυτών, διερευνήσαμε τις αλληλεπιδράσεις με διαιτητικούς παράγοντες, ενώ κατασκευάστηκαν επίσης δίκτυα γονιδίων-μεταβολιτών-διατροφής χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα Cytoscape και «ανάλυση ενοποίησης δεδομένων για την ανακάλυψη βιοδεικτών χρησιμοποιώντας προσεγγίσεις λανθανουσών μεταβλητών για μελέτες Omics» (DIABLO) αντίστοιχα. Στα δείγματα ορού, συμπληρωματικά της προσέγγισης NMR, χρησιμοποιήθηκαν δεδομένα Φασματομετρίας Μάζας (MS) από την πλατφόρμα Metabolon για στοχευμένη ανάλυση. Στην ανάλυση του CRC, πραγματοποιήθηκε ανάλυση μενδελιανής τυχαιοποίησης (MR) για να διαπιστωθεί η σχέση αιτίου-αιτιατού των σημαντικών μεταβολιτών στην αύξηση του κινδύνου για CRC. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι υπάρχει συσχέτιση μεταξύ του γονότυπου και του μεταβολώματος για τις εξεταζόμενες νόσους. Στην ανάλυση του CRC, ένας μεγάλος αριθμός μεταβολιτών έδειξε ισχυρή συσχέτιση με γενετικούς πολυμορφισμούς, μεταξύ των οποίων σάκχαρα (σακχαρόζη, γλυκόζη), αμινοξέα (τυροσίνη, λευκίνη, λυσίνη, γλουταμίνη), μεταβολίτες του εντερικού μικροβιώματος (θειικό άλας π-κρεσόλης, Ν-οξείδιο της τριμεθυλαμίνης (TMAO)), καθώς και λιπίδια και σωματίδια λιποπρωτεΐνων. Μεταξύ των γενετικών πολυμορφισμών που έδειξαν συσχέτιση με το μεταβόλωμα ήταν οι rs10411210 στο γονίδιο Rhophillin Binding Protein 2 (RHPN2), rs78368589 στο γονίδιο Solute Carrier Family 6 Μember 18 (SLC6A18) και rs745213 στο γονίδιο Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase 5 (MAP2K5) στην ανάλυση των μεταβολιτών στα δείγματα ούρων και rs174533 στο γονίδιο Myelin Regulator Factor (MYRF) στην ανάλυση των μεταβολιτών του αίματος. Ένα από τα σημαντικότερα ευρήματά μας ήταν η συσχέτιση του rs10411210 με τα επίπεδα σακχαρόζης στα ούρα. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν μια σχέση μεταξύ του RHPN2 και της έκφρασης της σουκράσης-ισομαλτάσης (SI) μέσω της ενεργοποίησης της Ροφιλλίνης Α, η οποία οδηγεί περαιτέρω σε μειωμένα επίπεδα σακχαρόζης στα ούρα. Ο ρόλος της SI στον CRC είναι ήδη γνωστός, ωστόσο από όσο γνωρίζουμε δεν υπάρχει μελέτη που να συνδέει τα επίπεδα σακχαρόζης των ούρων με τον κίνδυνο ανάπτυξης CRC. Επιπλέον, στη μελέτη αυτή προτείνονται νέοι μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους οι μεταβολίτες του μικροβιώματος του εντέρου, το TMAO και το θειικό άλας της π-κρεσόλης, εμπλέκονται στην παθογένεση του CRC. Τέλος, μεταξύ των παραγόντων του τρόπου ζωής, η κατανάλωση αλκοόλ παρουσίασε τις πιο ισχυρές συσχετίσεις με τους περισσότερους από τους σημαντικούς μεταβολίτες. Στην ανάλυση του MM, αναδείχθηκε η συσχέτιση διάφορων μεταβολιτών με τους γενετικούς πολυμορφισμούς που έχουν συνδεθεί με το ΜΜ. Μεταξύ των σημαντικότερων ευρημάτων ήταν η συσχέτιση του rs139371 στο γονίδιο Chromobox Protein Homolog 7 (CBX7), με τα επίπεδα τυροσίνης στα ούρα. Το γονίδιο αυτό έχει συνδεθεί στο παρελθόν τόσο με ΜΜ όσο και με καρκίνο του θυρεοειδούς, παρέχοντας νέα στοιχεία σχετικά για την επίδραση των θυρεοειδικών ορμονών στον καρκίνο. Επιπλέον, η συσχέτιση του λόγου Ν,Ν-διμέθυλογλυκίνη/γλυκίνη με τον γενετικό πολυμορφισμό rs58618031 στο γονίδιο Protection of telomeres protein 1 (POT1) ανέδειξε το ρόλο του μεταβολισμού της ομοκυστεΐνης στη διαδικασία σύντμησης των τελομερών. Το αποτέλεσμα αυτό έδειξε επίσης της σημασία που έχει η χρήση των λόγων των μεταβολιτών στις μελέτες ΜWAS για την ανάδειξη νέων συσχετίσεων. Σε ακόλουθη μελέτη, πραγματοποιήσαμε ανάλυση μεταβολομικής με ΝΜR σε ασθενείς με MM, προκειμένου να αναζητήσουμε μεταβολικούς δείκτες που θα μπορούσαν να διαχωρίσουν τους ασθενείς με MM που ανταποκρίνονται στη θεραπεία με μονοκλωνικά αντισώματα από εκείνους που δεν ανταποκρίνονται. Συλλέχθηκε πλάσμα περιφερικού αίματος (PB) και μυελού των οστών (BM) από ασθενείς με MM κατά τη στιγμή της διάγνωσης (Baseline-BL) και μετά τη θεραπεία. Αυτή η μελέτη κατέδειξε το ρόλο του μεταβολισμού του γλουταμινικού οξέος και της γλουταμίνης τόσο στο PB όσο και στο BM των ασθενών με MM, ενώ οι μεταβολές στο BM ήταν πολύ ισχυρότερες από εκείνες που αναφέρθηκαν στο PΒ. Επισημάνθηκε επίσης ο ρόλος πολλών αμινοξέων, συμπεριλαμβανομένης της τυροσίνης και των αμινοξέων διακλαδισμένης αλυσίδας που προέκυψαν και στην ανάλυση ΜWAS. Τέλος, το γαλακτικό οξύ αναδύθηκε ως κύριος μεταβολίτης για την πρόγνωση των ασθενών με MM, ενώ άλλα οργανικά οξέα (οξικό, πυροσταφυλλικό και κιτρικό οξύ) είχαν επίσης μεγάλο ρόλο στην διάκριση των ασθενών με βάση την απόκριση τους στη θεραπεία. Στην ανάλυση της BP εξετάστηκαν πάνω από 1000 γενετικoί πολυμορφισμοί για συσχετίσεις με μεταβολικούς δείκτες στα ούρα. Μεταξύ των πιο ισχυρών συσχετίσεων ήταν αυτή του πολυμορφισμού rs1047891 στο γονίδιο Carbamoyl-Φωσφορική Συνθάση 1 (CPS1) με τα επίπεδα γλυκίνης, κρεατίνης και γουανιδοοξικού οξέος στο αίμα και τα ούρα. Το γονίδιο αυτό κωδικοποιεί ένα ένζυμο υπεύθυνο για τη ρύθμιση του κύκλου της ουρίας. Αν και η συσχέτιση μεταξύ του CPS1 και των επιπέδων γλυκίνης στο αίμα ήταν ήδη γνωστή, εντοπίστηκαν και άλλοι μεταβολίτες εμπλεκόμενοι στην προτεινόμενη βιολογική οδό, ενώ δείξαμε ότι η συσχέτιση αυτή απεικονίζεται σε μικρότερο βαθμό στα επίπεδα των μεταβολιτών στα ούρα. Πληθώρα άλλων γενετικών πολυμορφισμών παρουσίασαν επίσης συσχετίσεις με μεταβολίτες στα ούρα, κυρίως μεταβολίτες που σχετίζονται με το μικροβίωμα του εντέρου, όπως το ιππουρικό οξύ, το TMAO και το 3-(3-υδροξυφαινυλ)-3-υδροξυπροπιονικό οξύ, καθώς και μεταβολίτες που σχετίζονται με τον καφέ, όπως το οξύ τoυ Sumiki, η τριγoνελλίνη και το Ν-μεθυλοπυριδίνιο. Τέλος, η πολυμεταβλητή ανάλυσή DIABLO, η οποία χρησιμοποιήθηκε για την ενοποίηση των δεδομένων GWAS, μεταβολομικής και διατροφής στην πρόβλεψη των αποτελεσμάτων BP (συστολική και διαστολική BP), τόνισε το ρόλο του φύλου και της κατανάλωσης αλκοόλ στην υπέρταση. Συνολικά, στη μελέτη αυτή αναδείχθηκαν μεταβολίτες και γενετικοί πολυμορφισμοί που εμπλέκονται στην παθολογία των εξεταζόμενων ασθενειών παρέχοντας νέες γνώσεις για τους μοριακούς μηχανισμούς του καρκίνου και της BP και ανοίγοντας το δρόμο για νέες θεραπευτικές ή προληπτικές στρατηγικές για αυτές τις ασθένειες. Ωστόσο, θα πρέπει να ακολουθήσει επαλήθευση των αποτελεσμάτων με in vivo/ in vitro μελέτες προκειμένου να προκύψουν περισσότερα στοιχεία για τις προτεινόμενες μοριακές οδούς, καθώς και αναπαραγωγή των αποτελεσμάτων (replication) σε ανεξάρτητες κοόρτες.In recent years Genome-Wide association studies (GWAS) have identified a plethora of genetic variants associated with complex diseases and traits. Although the molecular mechanisms implicating these variants in the associated disease may be known for a small number of them, for the vast majority they remain largely unexplored. Moreover, effect sizes of genetic associations with diseases are generally small requiring huge cohorts. For these reasons, GWAS findings have led to poor improvements in the clinical management of the associated disease. A shift has been observed from GWAS to intermediate trait associations, such as RNA transcription or metabolites that are known risk factors of disease (such as triglyceride or glucose levels), which are generally characterized by larger effect sizes as there are closer to the clinical endpoints compared to the genotype. In the last decade, metabolomics has emerged as a powerful tool for the comprehensive measurement of low molecular weight molecules in biological fluids, allowing for simultaneous detection and quantitation of a variety of small molecules with different chemical properties and structures. Another important aspect of metabolomics is that the metabolome reflects the effect of both intrinsic and extrinsic exposures. Therefore, both genetic and environmental impacts on the clinical phenotype can be explored. Recent studies have explored GWAS associations in a metabolomics setup known as Genome-wide association studies of metabolites concentrations (mGWAS). However, all of these studies have explored thousands of genetic variants with metabolic trait phenotypes in a general context and irrespectively of the associated diseases. In this study the aim was to perform a metabolome-wide association study (MWAS) with genetic variants previously associated with a specific complex disease, such as cancer types and Cardiovascular Diseases (CVDs), in order to thoroughly investigate the gene-metabolite interactions and reveal underlying causal pathways of the disease in a GWAS agnostic context. The link between genetic variants previously associated with three complex diseases, Colorectal Cancer (CRC), Multiple Myeloma (MM) and Blood Pressure (BP), with metabolites as intermediated traits has been investigated using a Nuclear Magnetic Resonance (NMR)-based metabolomics approach in a large UK population cohort. More specifically, GWAS data, as well as NMR metabolomics data for urine and blood from 1,974 Airwave Health Monitoring Study participants were analysed. Initial method development has been performed, highlighting the urge of simultaneous implementation of both targeted and untargeted metabolomics approaches. We also tried to investigate the use of multivariate approaches, which has not yet been explored and established in this kind of studies. Utilization of multivariate approaches is of high importance in order to account for the dependency structures in omics data. Another asset of this study is the simultaneous analysis of both plasma and urine samples, with the urinary metabolome being largely unexplored in a GWAS context. We performed urine annotation in the NMR spectra of the Airwave Health Monitoring Study (AIRWAVE), using 2D NMR experiments, statistical approaches (e.g. Statistical total correlation spectroscopy-STOCSY), as well as spiking experiments. Based on our method development, for each genetic variant, Spearman partial correlation analysis was conducted against the 1H NMR spectral data. All univariate analyses were adjusted for confounders and corrected at 5% False Discovery Rate (untargeted approach) or 5% Bonferroni (targeted approach). We also made use of metabolic ratios, which have previously been found to increase the association of a product-substrate pair. Multivariate approaches, such as Knowledge Discovery by Accuracy Maximization (KODAMA) and sparse Partial Least Squares Regression (sPLS) were also employed in order to reveal more information on the relationship between genetic variants and the metabolic traits in a multivariate framework. For CRC and BP, where the environmental factors are known to pose an important role in their pathogenesis, we also investigated the interactions with dietary factors, while gene-metabolite-diet networks have also been constructed using Cytoscape and Data Integration Analysis for Biomarker discovery using Latent variable approaches for ‘Omics studies (DIABLO) respectively. In serum, the Metabolon Mass Spectrometry (MS) platform has also been utilized for targeted MS analysis complementary to the NMR approach. In CRC analysis, Mendelian randomization (MR) analysis has been performed to establish causality of the identified metabolites in increasing the risk of CRC. Our results demonstrated a correlation between the genotype and metabolome of the examined diseases. In CRC analysis, several metabolites including sugars (sucrose, glucose), amino acids (tyrosine, leucine, lysine, glutamine), gut microbial metabolites (p-cresol sulfate, Trimethylamine-N-oxide (TMAO)), as well as lipids and lipoprotein particles have shown strong association with CRC genetic variants. Among the associated variants were rs10411210 in Rhophillin binding protein 2 (RHPN2) gene, rs78368589 in Solute Carrier Family 6 Member 18 (SLC6A18) gene and rs745213 in the Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase 5 (MAP2K5) gene in the analysis of urinary metabolites and rs174533 in the Myelin Regulatory Factor (MYRF) gene for blood analysis. One of our major findings was the association for rs10411210 with sucrose levels. Our results suggest a relationship between the RHPN2 and sucrase-isomaltase (SI) expression through activation of Rhophillin A, which further results in decreased urinary levels of sucrose. Although the role of SI in CRC has been well-established, to our knowledge there is no study associating the urinary levels of sucrose with the risk of developing CRC. Moreover, we proposed novel molecular mechanisms implicating the gut microbial metabolites, TMAO and p-cresol sulfate, in the pathogenesis of CRC. Finally, among the lifestyle factors alcohol consumption exhibited strong associations with most of the implicated metabolites. In MM analysis, several metabolites exhibited associations with MM genetic variants. Among the most important findings was the association of rs139371 in the Chromobox Protein Homolog 7 (CBX7) gene, which has been previously linked to both MM and thyroid cancer, with urinary tyrosine levels, providing further evidence about the effect of thyroid hormones in cancer. Moreover, association of the N,N dimethylglycine/glycine ratio with rs58618031 variant in Protection of Telomeres 1 (POT1) gene highlighted the role of homocysteine metabolism in telomere shortening. This result further demonstrated the advantageous investigation of metabolic ratios. In a subsequent study, we performed an NMR-based metabolomics in MM patients in order to seek for metabolic markers that could discriminate between MM patients that respond compared to those that not respond to treatment with monoclonal antibodies. Peripheral blood (PB) and bone marrow (BM) plasma from MM patients was collected at baseline (BL), e.g. at the time of diagnosis, and after treatment. This study demonstrated the role of glutamic acid and glutamine pathway in both PB and BM plasma of MM patients, while the alterations in BM were much stronger than those reported in the PΒ. The role of several amino acids, including tyrosine and branched chain amino acids also found in our MWAS analysis, has also been highlighted. Finally, lactic acid has emerged as a key metabolite for prognosis of MM patients, while other organic acids (acetic, pyruvic and citric acid) also posed a significant effect in their discrimination. In BP analysis over 1000 BP genetic variants were examined for associations with urinary metabolic markers. Among the most profound association was that of the rs1047891 variant in the Carbamoyl-Phosphate Synthase 1 (CPS1) gene, encoding for an enzyme responsible for the rate-limiting step of the urea cycle, with glycine, creatine and guanidoacetic acid both in blood and urine. Although the association between CPS1 and blood levels of glycine was already known, other metabolites of the proposed pathway have been identified, while the association was also depicted in the urinary levels of these metabolites. Several other variants exhibited associations with urinary metabolites, mostly gut microbiota related metabolites, such as hippuric acid, TMAO and 3-(3-hydroxyphenyl)-3-hydroxypropionic acid, and coffee related metabolites, such as sumiki’s acid, trigonelline and N-methylpyridinium. Finally, our multivariate analysis using DIABLO that integrated GWAS, metabolomics and dietary data for the prediction of BP outcomes (systolic and diastolic BP), highlighted the role of gender and alcohol consumption in hypertension. Overall, our analyses helped us highlight the metabolites and variants that could pose a key role in pathology of the examined diseases providing new insights on cancer and BP pathogenesis and paving the way to novel therapeutic or preventive strategies for these diseases. However, follow-up in vivo/ in vitro studies will be needed in order to provide evidence on the proposed molecular pathways, as well as replication to independent cohorts

Μελέτες συσχέτισης ολικού μεταβολώματος με γενετικούς πολυμορφισμούς που έχουν συνδεθεί με το καρκίνο του παχέος εντέρου, το πολλαπλό μυέλωμα και την υψηλή αρτηριακή πίεση

In recent years Genome-Wide association studies (GWAS) have identified a plethora of genetic variants associated with complex diseases and traits. Although the molecular mechanisms implicating these variants in the associated disease may be known for a small number of them, for the vast majority they remain largely unexplored. Moreover, effect sizes of genetic associations with diseases are generally small requiring huge cohorts. For these reasons, GWAS findings have led to poor improvements in the clinical management of the associated disease. A shift has been observed from GWAS to intermediate trait associations, such as RNA transcription or metabolites that are known risk factors of disease (such as triglyceride or glucose levels), which are generally characterized by larger effect sizes as there are closer to the clinical endpoints compared to the genotype. In the last decade, metabolomics has emerged as a powerful tool for the comprehensive measurement of low molecular weight molecules in biological fluids, allowing for simultaneous detection and quantitation of a variety of small molecules with different chemical properties and structures. Another important aspect of metabolomics is that the metabolome reflects the effect of both intrinsic and extrinsic exposures. Therefore, both genetic and environmental impacts on the clinical phenotype can be explored. Recent studies have explored GWAS associations in a metabolomics setup known as Genome-wide association studies of metabolites concentrations (mGWAS). However, all of these studies have explored thousands of genetic variants with metabolic trait phenotypes in a general context and irrespectively of the associated diseases. In this study the aim was to perform a metabolome-wide association study (MWAS) with genetic variants previously associated with a specific complex disease, such as cancer types and Cardiovascular Diseases (CVDs), in order to thoroughly investigate the gene-metabolite interactions and reveal underlying causal pathways of the disease in a GWAS agnostic context. The link between genetic variants previously associated with three complex diseases, Colorectal Cancer (CRC), Multiple Myeloma (MM) and Blood Pressure (BP), with metabolites as intermediated traits has been investigated using a Nuclear Magnetic Resonance (NMR)-based metabolomics approach in a large UK population cohort. More specifically, GWAS data, as well as NMR metabolomics data for urine and blood from 1,974 Airwave Health Monitoring Study participants were analysed. Initial method development has been performed, highlighting the urge of simultaneous implementation of both targeted and untargeted metabolomics approaches. We also tried to investigate the use of multivariate approaches, which has not yet been explored and established in this kind of studies. Utilization of multivariate approaches is of high importance in order to account for the dependency structures in omics data. Another asset of this study is the simultaneous analysis of both plasma and urine samples, with the urinary metabolome being largely unexplored in a GWAS context. We performed urine annotation in the NMR spectra of the Airwave Health Monitoring Study (AIRWAVE), using 2D NMR experiments, statistical approaches (e.g. Statistical total correlation spectroscopy-STOCSY), as well as spiking experiments. Based on our method development, for each genetic variant, Spearman partial correlation analysis was conducted against the 1H NMR spectral data. All univariate analyses were adjusted for confounders and corrected at 5% False Discovery Rate (untargeted approach) or 5% Bonferroni (targeted approach). We also made use of metabolic ratios, which have previously been found to increase the association of a product-substrate pair. Multivariate approaches, such as Knowledge Discovery by Accuracy Maximization (KODAMA) and sparse Partial Least Squares Regression (sPLS) were also employed in order to reveal more information on the relationship between genetic variants and the metabolic traits in a multivariate framework. For CRC and BP, where the environmental factors are known to pose an important role in their pathogenesis, we also investigated the interactions with dietary factors, while gene-metabolite-diet networks have also been constructed using Cytoscape and Data Integration Analysis for Biomarker discovery using Latent variable approaches for ‘Omics studies (DIABLO) respectively. In serum, the Metabolon Mass Spectrometry (MS) platform has also been utilized for targeted MS analysis complementary to the NMR approach. In CRC analysis, Mendelian randomization (MR) analysis has been performed to establish causality of the identified metabolites in increasing the risk of CRC.Our results demonstrated a correlation between the genotype and metabolome of the examined diseases. In CRC analysis, several metabolites including sugars (sucrose, glucose), amino acids (tyrosine, leucine, lysine, glutamine), gut microbial metabolites (p-cresol sulfate, Trimethylamine-N-oxide (TMAO)), as well as lipids and lipoprotein particles have shown strong association with CRC genetic variants. Among the associated variants were rs10411210 in Rhophillin binding protein 2 (RHPN2) gene, rs78368589 in Solute Carrier Family 6 Member 18 (SLC6A18) gene and rs745213 in the Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase 5 (MAP2K5) gene in the analysis of urinary metabolites and rs174533 in the Myelin Regulatory Factor (MYRF) gene for blood analysis. One of our major findings was the association for rs10411210 with sucrose levels. Our results suggest a relationship between the RHPN2 and sucrase-isomaltase (SI) expression through activation of Rhophillin A, which further results in decreased urinary levels of sucrose. Although the role of SI in CRC has been well-established, to our knowledge there is no study associating the urinary levels of sucrose with the risk of developing CRC. Moreover, we proposed novel molecular mechanisms implicating the gut microbial metabolites, TMAO and p-cresol sulfate, in the pathogenesis of CRC. Finally, among the lifestyle factors alcohol consumption exhibited strong associations with most of the implicated metabolites.In MM analysis, several metabolites exhibited associations with MM genetic variants. Among the most important findings was the association of rs139371 in the Chromobox Protein Homolog 7 (CBX7) gene, which has been previously linked to both MM and thyroid cancer, with urinary tyrosine levels, providing further evidence about the effect of thyroid hormones in cancer. Moreover, association of the N,N dimethylglycine/glycine ratio with rs58618031 variant in Protection of Telomeres 1 (POT1) gene highlighted the role of homocysteine metabolism in telomere shortening. This result further demonstrated the advantageous investigation of metabolic ratios. In a subsequent study, we performed an NMR-based metabolomics in MM patients in order to seek for metabolic markers that could discriminate between MM patients that respond compared to those that not respond to treatment with monoclonal antibodies. Peripheral blood (PB) and bone marrow (BM) plasma from MM patients was collected at baseline (BL), e.g. at the time of diagnosis, and after treatment. This study demonstrated the role of glutamic acid and glutamine pathway in both PB and BM plasma of MM patients, while the alterations in BM were much stronger than those reported in the PΒ. The role of several amino acids, including tyrosine and branched chain amino acids also found in our MWAS analysis, has also been highlighted. Finally, lactic acid has emerged as a key metabolite for prognosis of MM patients, while other organic acids (acetic, pyruvic and citric acid) also posed a significant effect in their discrimination.In BP analysis over 1000 BP genetic variants were examined for associations with urinary metabolic markers. Among the most profound association was that of the rs1047891 variant in the Carbamoyl-Phosphate Synthase 1 (CPS1) gene, encoding for an enzyme responsible for the rate-limiting step of the urea cycle, with glycine, creatine and guanidoacetic acid both in blood and urine. Although the association between CPS1 and blood levels of glycine was already known, other metabolites of the proposed pathway have been identified, while the association was also depicted in the urinary levels of these metabolites. Several other variants exhibited associations with urinary metabolites, mostly gut microbiota related metabolites, such as hippuric acid, TMAO and 3-(3-hydroxyphenyl)-3-hydroxypropionic acid, and coffee related metabolites, such as sumiki’s acid, trigonelline and N-methylpyridinium. Finally, our multivariate analysis using DIABLO that integrated GWAS, metabolomics and dietary data for the prediction of BP outcomes (systolic and diastolic BP), highlighted the role of gender and alcohol consumption in hypertension.Overall, our analyses helped us highlight the metabolites and variants that could pose a key role in pathology of the examined diseases providing new insights on cancer and BP pathogenesis and paving the way to novel therapeutic or preventive strategies for these diseases. However, follow-up in vivo/ in vitro studies will be needed in order to provide evidence on the proposed molecular pathways, as well as replication to independent cohorts.Τα τελευταία χρόνια οι μελέτες συσχέτισης ολικού γονιδιώματος (GWAS) έχουν εντοπίσει μια πληθώρα γενετικών πολυμορφισμών που σχετίζονται με πολύπλοκες ασθένειες. Για έναν μικρό αριθμό γενετικών πολυμορφισμών, οι μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους αυτοί συνδέονται με τη σχετιζόμενη ασθένεια είναι γνωστοί. Ωστόσο, για τη συντριπτική πλειοψηφία αυτών παραμένουν σε μεγάλο βαθμό ανεξερεύνητοι. Επιπλέον, τα μεγέθη επίδρασης των γενετικών συσχετίσεων με ασθένειες είναι γενικά μικρά και απαιτούν κοόρτες με πολύ μεγάλο μέγεθος πληθυσμού. Για τους λόγους αυτούς, τα ευρήματα των GWAS δεν έχουν οδηγήσει σε σημαντικές βελτιώσεις στην κλινική διαχείριση των σχετιζόμενων νόσων. Οι κλασικές GWAS μελέτες έχουν επεκταθεί σε μελέτες συσχέτισης με ενδιάμεσα χαρακτηριστικά, όπως η έκφραση RNA ή μεταβολίτες που είναι γνωστοί παράγοντες κινδύνου της εξεταζόμενης νόσου (όπως τα επίπεδα τριγλυκεριδίων ή γλυκόζης). Τα χαρακτηριστικά αυτά εμφανίζουν μεγαλύτερα μεγέθη επίδρασης καθώς βρίσκονται πιο κοντά στο κλινικό αποτέλεσμα σε σύγκριση με τον γονότυπο. Την τελευταία δεκαετία, η μεταβολομική έχει αναδυθεί ως ένα ισχυρό εργαλείο για την ενδελεχή μέτρηση των μεταβολιτών, δηλαδή μορίων χαμηλού μοριακού βάρους, στα βιολογικά υγρά, επιτρέποντας την ταυτόχρονη ανίχνευση και ποσοτικοποίηση μιας ποικιλίας μικρών μορίων με διαφορετικές χημικές ιδιότητες και δομές. Μια άλλη σημαντική πτυχή της μεταβολομικής είναι ότι το μεταβόλωμα αντανακλά την επίδραση τόσο των ενδογενών όσο και των εξωγενών εκθέσεων. Ως εκ τούτου, επιτρέπει τη διερεύνηση τόσο των γενετικών όσο και των περιβαλλοντικών επιπτώσεων στον κλινικό φαινότυπο. Πρόσφατες μελέτες έχουν διερευνήσει τη συσχέτιση δεδομένων GWAS με δεδομένα μεταβολομικής, γνωστές ως μελέτες συσχέτισης ολικού γονιδιώματος με συγκεντρώσεις μεταβολιτών (mGWAS). Σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να εφαρμόσει μια στρατηγική ανάλυσης συσχέτισης ολικού μεταβολώματος (ΜWAS) με γενετικές παραλλαγές που έχουν προηγουμένως συσχετισθεί με μια συγκεκριμένη σύνθετη ασθένεια, όπως διάφοροι τύποι καρκίνου και καρδιαγγειακές νόσοι, προκειμένου να διερευνηθούν διεξοδικά οι αλληλεπιδράσεις γονιδίων-μεταβολιτών και να αποκαλυφθούν υποκείμενες μεταβολικοί οδοί της νόσου στο αγνωστικιστικό πλαίσιο των GWAS μελετών. Εξετάσθηκε η συσχέτιση γενετικών παραλλαγών που έχουν προηγουμένως συνδεθεί με τρεις σύνθετες ασθένειες, καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC), πολλαπλό μυέλωμα (MM) και υψηλή αρτηριακή πίεση (BP), με μεταβολίτες ως ενδιάμεσα χαρακτηριστικά, εφαρμόζοντάς μια μεταβολομική προσέγγιση μέσω φασματοσκοπίας Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (NMR) σε μια μεγάλη ομάδα πληθυσμού του Ηνωμένου Βασιλείου. Πιο συγκεκριμένα, αναλύθηκαν τα δεδομένα GWAS, καθώς και τα δεδομένα NMR ούρων και αίματος από 1,974 συμμετέχοντες στη Μελέτη Παρακολούθησης Της Υγείας των Ραδιοκυμάτων (ΑΙRWAVE). Αρχικά πραγματοποιήθηκε ανάπτυξη μεθοδολογίας, τονίζοντας την ανάγκη για ταυτόχρονη εφαρμογή τόσο στοχοθετημένων όσο και μη στοχευμένων προσεγγίσεων μεταβολομικής. Εξετάστηκε επίσης η χρήση πολυμεταβλητών προσεγγίσεων, η οποία δεν έχει ακόμη διερευνηθεί και καθιερωθεί σε αυτού του είδους τις μελέτες. Η χρήση των πολυμεταβλητών προσεγγίσεων είναι υψηλής σημασίας προκειμένου να ληφθούν υπόψη οι δομές εξάρτησης στα δεδομένα omics. Ένα άλλο πλεονέκτημα αυτής της μελέτης είναι η ταυτόχρονη ανάλυση δειγμάτων πλάσματος και ούρων, καθώς το μεταβόλωμα των ούρων παραμένει σε μεγάλο βαθμό ανεξερεύνητο στο πλαίσιο των GWAS. Πραγματοποιήσαμε απόδοση κορυφών και ταυτοποίηση των μεταβολιτών στα φάσματα NMR των ούρων για την AIRWAVE, χρησιμοποιώντας πειράματα 2D NMR, στατιστικές προσεγγίσεις (π.χ. στατιστική φασματοσκοπία συνολικής συσχέτισης-STOCSY), καθώς και πειράματα εμβολιασμού δειγμάτων με πρότυπες ουσίες. Με βάση την ανάπτυξη μεθοδολογίας, για κάθε γενετικό πολυμορφισμό πραγματοποιήθηκε ανάλυση μερικής συσχέτισης Spearman των δεδομένων NMR. Όλες οι μονομεταβλητές αναλύσεις προσαρμόστηκαν για συγχυτικούς παράγοντες (confounders) και διορθώθηκαν για 5% Ποσοστό Ψευδών Ανακαλύψεων (False Discovery Rate) (μη στοχευμένη προσέγγιση) ή στο 5% Bonferroni (στοχευμένη προσέγγιση). Χρησιμοποιήσαμε επίσης τους λόγους των μεταβολιτών, οι οποίοι έχει βρεθεί ότι αυξάνουν τη συσχέτιση για ένα ζεύγος προϊόντος-υποστρώματος. Χρησιμοποιήθηκαν επίσης πολυμεταβλητές προσεγγίσεις, όπως η ανακάλυψη γνώσης με μεγιστοποίηση της ακρίβειας (KODAMA) και η σποραδική παλινδρόμηση μερικών ελάχιστων τετραγώνων (SPLS) προκειμένου να διερευνηθεί η σχέση των γενετικών πολυμορφισμών και των μεταβολικών χαρακτηριστικών σε ένα πολυμεταβλητό πλαίσιο. Για την ανάλυση του CRC και της BP, όπου είναι γνωστό ότι οι περιβαλλοντικοί παράγοντες διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην παθογένεση των νόσων αυτών, διερευνήσαμε τις αλληλεπιδράσεις με διαιτητικούς παράγοντες, ενώ κατασκευάστηκαν επίσης δίκτυα γονιδίων-μεταβολιτών-διατροφής χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα Cytoscape και «ανάλυση ενοποίησης δεδομένων για την ανακάλυψη βιοδεικτών χρησιμοποιώντας προσεγγίσεις λανθανουσών μεταβλητών για μελέτες Omics» (DIABLO) αντίστοιχα. Στα δείγματα ορού, συμπληρωματικά της προσέγγισης NMR, χρησιμοποιήθηκαν δεδομένα Φασματομετρίας Μάζας (MS) από την πλατφόρμα Metabolon για στοχευμένη ανάλυση. Στην ανάλυση του CRC, πραγματοποιήθηκε ανάλυση μενδελιανής τυχαιοποίησης (MR) για να διαπιστωθεί η σχέση αιτίου-αιτιατού των σημαντικών μεταβολιτών στην αύξηση του κινδύνου για CRC. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι υπάρχει συσχέτιση μεταξύ του γονότυπου και του μεταβολώματος για τις εξεταζόμενες νόσους. Στην ανάλυση του CRC, ένας μεγάλος αριθμός μεταβολιτών έδειξε ισχυρή συσχέτιση με γενετικούς πολυμορφισμούς, μεταξύ των οποίων σάκχαρα (σακχαρόζη, γλυκόζη), αμινοξέα (τυροσίνη, λευκίνη, λυσίνη, γλουταμίνη), μεταβολίτες του εντερικού μικροβιώματος (θειικό άλας π-κρεσόλης, Ν-οξείδιο της τριμεθυλαμίνης (TMAO)), καθώς και λιπίδια και σωματίδια λιποπρωτεΐνων. Μεταξύ των γενετικών πολυμορφισμών που έδειξαν συσχέτιση με το μεταβόλωμα ήταν οι rs10411210 στο γονίδιο Rhophillin Rho Binding Protein 2 (RHPN2), rs78368589 στο γονίδιο Solute Carrier Family 6 Μember 18 (SLC6A18) και rs745213 στο γονίδιο Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase 5 (MAP2K5) στην ανάλυση των μεταβολιτών στα δείγματα ούρων και rs174533 στο γονίδιο Myelin Regulator Factor (MYRF) στην ανάλυση των μεταβολιτών του αίματος. Ένα από τα σημαντικότερα ευρήματά μας ήταν η συσχέτιση του rs10411210 με τα επίπεδα σακχαρόζης στα ούρα. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν μια σχέση μεταξύ του RHPN2 και της έκφρασης της σουκράσης-ισομαλτάσης (SI) μέσω της ενεργοποίησης της Ροφιλλίνης Α, η οποία οδηγεί περαιτέρω σε μειωμένα επίπεδα σακχαρόζης στα ούρα. Ο ρόλος της SI στον CRC είναι ήδη γνωστός, ωστόσο από όσο γνωρίζουμε δεν υπάρχει μελέτη που να συνδέει τα επίπεδα σακχαρόζης των ούρων με τον κίνδυνο ανάπτυξης CRC. Επιπλέον, στη μελέτη αυτή προτείνονται νέοι μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους οι μεταβολίτες του μικροβιώματος του εντέρου, το TMAO και το θειικό άλας της π-κρεσόλης, εμπλέκονται στην παθογένεση του CRC. Τέλος, μεταξύ των παραγόντων του τρόπου ζωής, η κατανάλωση αλκοόλ παρουσίασε τις πιο ισχυρές συσχετίσεις με τους περισσότερους από τους σημαντικούς μεταβολίτες. Στην ανάλυση του MM, αναδείχθηκε η συσχέτιση διάφορων μεταβολιτών με τους γενετικούς πολυμορφισμούς που έχουν συνδεθεί με το ΜΜ. Μεταξύ των σημαντικότερων ευρημάτων ήταν η συσχέτιση του rs139371 στο γονίδιο Chromobox Protein Homolog 7 (CBX7), με τα επίπεδα τυροσίνης στα ούρα. Το γονίδιο αυτό έχει συνδεθεί στο παρελθόν τόσο με ΜΜ όσο και με καρκίνο του θυρεοειδούς, παρέχοντας νέα στοιχεία σχετικά για την επίδραση των θυρεοειδικών ορμονών στον καρκίνο. Επιπλέον, η συσχέτιση του λόγου Ν,Ν-διμέθυλογλυκίνη/γλυκίνη με τον γενετικό πολυμορφισμό rs58618031 στο γονίδιο Protection of telomeres protein 1 (POT1) ανέδειξε το ρόλο του μεταβολισμού της ομοκυστεΐνης στη διαδικασία σύντμησης των τελομερών. Το αποτέλεσμα αυτό έδειξε επίσης της σημασία που έχει η χρήση των λόγων των μεταβολιτών στις μελέτες ΜWAS για την ανάδειξη νέων συσχετίσεων. Σε ακόλουθη μελέτη, πραγματοποιήσαμε ανάλυση μεταβολομικής με ΝΜR σε ασθενείς με MM, προκειμένου να αναζητήσουμε μεταβολικούς δείκτες που θα μπορούσαν να διαχωρίσουν τους ασθενείς με MM που ανταποκρίνονται στη θεραπεία με μονοκλωνικά αντισώματα από εκείνους που δεν ανταποκρίνονται. Συλλέχθηκε πλάσμα περιφερικού αίματος (PB) και μυελού των οστών (BM) από ασθενείς με MM κατά τη στιγμή της διάγνωσης (Baseline-BL) και μετά τη θεραπεία. Αυτή η μελέτη κατέδειξε το ρόλο του μεταβολισμού του γλουταμινικού οξέος και της γλουταμίνης τόσο στο PB όσο και στο BM των ασθενών με MM, ενώ οι μεταβολές στο BM ήταν πολύ ισχυρότερες από εκείνες που αναφέρθηκαν στο PΒ. Επισημάνθηκε επίσης ο ρόλος πολλών αμινοξέων, συμπεριλαμβανομένης της τυροσίνης και των αμινοξέων διακλαδισμένης αλυσίδας που προέκυψαν και στην ανάλυση ΜWAS. Τέλος, το γαλακτικό οξύ αναδύθηκε ως κύριος μεταβολίτης για την πρόγνωση των ασθενών με MM, ενώ άλλα οργανικά οξέα (οξικό, πυροσταφυλλικό και κιτρικό οξύ) είχαν επίσης μεγάλο ρόλο στην διάκριση των ασθενών με βάση την απόκριση τους στη θεραπεία. Στην ανάλυση της BP εξετάστηκαν πάνω από 1000 γενετικoί πολυμορφισμοί για συσχετίσεις με μεταβολικούς δείκτες στα ούρα. Μεταξύ των πιο ισχυρών συσχετίσεων ήταν αυτή του πολυμορφισμού rs1047891 στο γονίδιο Carbamoyl-Φωσφορική Συνθάση 1 (CPS1) με τα επίπεδα γλυκίνης, κρεατίνης και γουανιδοοξικού οξέος στο αίμα και τα ούρα. Το γονίδιο αυτό κωδικοποιεί ένα ένζυμο υπεύθυνο για τη ρύθμιση του κύκλου της ουρίας. Αν και η συσχέτιση μεταξύ του CPS1 και των επιπέδων γλυκίνης στο αίμα ήταν ήδη γνωστή, εντοπίστηκαν και άλλοι μεταβολίτες εμπλεκόμενοι στην προτεινόμενη βιολογική οδό, ενώ δείξαμε ότι η συσχέτιση αυτή απεικονίζεται σε μικρότερο βαθμό στα επίπεδα των μεταβολιτών στα ούρα. Πληθώρα άλλων γενετικών πολυμορφισμών παρουσίασαν επίσης συσχετίσεις με μεταβολίτες στα ούρα, κυρίως μεταβολίτες που σχετίζονται με το μικροβίωμα του εντέρου, όπως το ιππουρικό οξύ, το TMAO και το 3-(3-υδροξυφαινυλ)-3-υδροξυπροπιονικό οξύ, καθώς και μεταβολίτες που σχετίζονται με τον καφέ, όπως το οξύ τoυ Sumiki, η τριγoνελλίνη και το Ν-μεθυλοπυριδίνιο. Τέλος, η πολυμεταβλητή ανάλυσή DIABLO, η οποία χρησιμοποιήθηκε για την ενοποίηση των δεδομένων GWAS, μεταβολομικής και διατροφής στην πρόβλεψη των αποτελεσμάτων BP (συστολική και διαστολική BP), τόνισε το ρόλο του φύλου και της κατανάλωσης αλκοόλ στην υπέρταση. Συνολικά, στη μελέτη αυτή αναδείχθηκαν μεταβολίτες και γενετικοί πολυμορφισμοί που εμπλέκονται στην παθολογία των εξεταζόμενων ασθενειών παρέχοντας νέες γνώσεις για τους μοριακούς μηχανισμούς του καρκίνου και της BP και ανοίγοντας το δρόμο για νέες θεραπευτικές ή προληπτικές στρατηγικές για αυτές τις ασθένειες. Ωστόσο, θα πρέπει να ακολουθήσει επαλήθευση των αποτελεσμάτων με in vivo/ in vitro μελέτες προκειμένου να προκύψουν περισσότερα στοιχεία για τις προτεινόμενες μοριακές οδούς, καθώς και αναπαραγωγή των αποτελεσμάτων (replication) σε ανεξάρτητες κοόρτες

Metabolic phenotyping and cardiovascular disease: an overview of evidence from epidemiological settings

Metabolomics, the comprehensive measurement of low-molecular-weight molecules in biological fluids used for metabolic phenotyping, has emerged as a promising tool to better understand pathways underlying cardiovascular disease (CVD) and to improve cardiovascular risk stratification. Here, we present the main methodologies for metabolic phenotyping, the methodological steps to analyse these data in epidemiological settings and the associated challenges. We discuss evidence from epidemiological studies linking metabolites to coronary heart disease and stroke. These studies indicate the systemic nature of CVD and identify associated metabolic pathways such as gut microbial cometabolism, branched-chain amino acids, glycerophospholipid and cholesterol metabolism, as well as activation of inflammatory processes. Integration of metabolomic with genomic data can provide new evidence for involved biochemical pathways and potential for causality using Mendelian randomisation. The clinical utility of metabolic biomarkers for cardiovascular risk stratification in healthy individuals has not yet been established. As sample sizes with high-dimensional molecular data increase in epidemiological settings, integration of metabolomic data across studies and platforms with other molecular data will lead to new understanding of the metabolic processes underlying CVD and contribute to identification of potentially novel preventive and pharmacological targets. Metabolic phenotyping offers a powerful tool in the characterisation of the molecular signatures of CVD, paving the way to new mechanistic understanding and therapies, as well as improving risk prediction of CVD patients. However, there are still challenges to face in order to contribute to clinically important improvements in CVD

Chemometrically Assisted Optimization of Pregabalin Fluorescent Derivatization Reaction with a Novel Xanthone Analogue and Validation of the Method for the Determination of Pregabalin in Bulk via a Plate Reader

Quantitation of chromophore-free analytes is always a challenge. To this purpose, derivatization of the analyte constitutes a common strategy, leading to a product with a strong signal. In the current study, a novel xanthone analogue was utilized for the first time for the derivatization of pregabalin, a model analyte with a primary amine moiety that lacks a chromophore. The fact that only the xanthene-based derivative, formed after the derivatization reaction fluoresces, enables avoiding its chromatographic separation from the reagent and thus reducing the analysis time of a series of samples in 1&ndash;2 min via a plate reader. The reaction conditions were optimized via a central composite design (CCD), with fluorescence signal as the measure of the yield. The following factors that affect the derivatization reaction were chosen: (a) temperature, (b) reaction time, and (c) triethylamine solution volume used to drive the reaction to completion. After the identification of the optimal conditions, the method was validated according to ICH guidelines, using a fluorescence plate reader for signal measurement (&lambda;ex = 540, &lambda;em = 615 nm). Finally, the newly developed high-throughput method was applied to the determination of drug content in pregabalin bulk

Human Melanoma-Cell Metabolic Profiling: Identification of Novel Biomarkers Indicating Metastasis

Melanoma is the most aggressive type of skin cancer, leading to metabolic rewiring and enhancement of metastatic transformation. Efforts to improve its early and accurate diagnosis are largely based on preclinical models and especially cell lines. Hence, we herein present a combinational Nuclear Magnetic Resonance (NMR)- and Ultra High Performance Liquid Chromatography-High-Resolution Tandem Mass Spectrometry (UHPLC-HRMS/MS)-mediated untargeted metabolomic profiling of melanoma cells, to landscape metabolic alterations likely controlling metastasis. The cell lines WM115 and WM2664, which belong to the same patient, were examined, with WM115 being derived from a primary, pre-metastatic, tumor and WM2664 clonally expanded from lymph-node metastases. Metabolite samples were analyzed using NMR and UHPLC-HRMS. Multivariate statistical analysis of high resolution NMR and MS (positive and negative ionization) results was performed by Principal Component Analysis (PCA), Partial Least Squares-Discriminant Analysis (PLS-DA) and Orthogonal Partial Least Squares-Discriminant Analysis (OPLS-DA), while metastasis-related biomarkers were determined on the basis of VIP lists, S-plots and Student&rsquo;s t-tests. Receiver Operating Characteristic (ROC) curves of NMR and MS data revealed significantly differentiated metabolite profiles for each cell line, with WM115 being mainly characterized by upregulated levels of phosphocholine, choline, guanosine and inosine. Interestingly, WM2664 showed notably increased contents of hypoxanthine, myo-inositol, glutamic acid, organic acids, purines, pyrimidines, AMP, ADP, ATP and UDP(s), thus indicating the critical roles of purine, pyrimidine and amino acid metabolism during human melanoma metastasis

Plasma Metabolomic Alterations Induced by COVID-19 Vaccination Reveal Putative Biomarkers Reflecting the Immune Response

Vaccination is currently the most effective strategy for the mitigation of the COVID-19 pandemic. mRNA vaccines trigger the immune system to produce neutralizing antibodies (NAbs) against SARS-CoV-2 spike proteins. However, the underlying molecular processes affecting immune response after vaccination remain poorly understood, while there is significant heterogeneity in the immune response among individuals. Metabolomics have often been used to provide a deeper understanding of immune cell responses, but in the context of COVID-19 vaccination such data are scarce. Mass spectrometry (LC-MS) and nuclear magnetic resonance (NMR)-based metabolomics were used to provide insights based on the baseline metabolic profile and metabolic alterations induced after mRNA vaccination in paired blood plasma samples collected and analysed before the first and second vaccination and at 3 months post first dose. Based on the level of NAbs just before the second dose, two groups, “low” and “high” responders, were defined. Distinct plasma metabolic profiles were observed in relation to the level of immune response, highlighting the role of amino acid metabolism and the lipid profile as predictive markers of response to vaccination. Furthermore, levels of plasma ceramides along with certain amino acids could emerge as predictive biomarkers of response and severity of inflammation