Armeria maritima — the plant species adapted to growth on soils polluted by heavy metals

Armeria maritima plants grow on unpolluted sandy soils and on soils strongly polluted by heavy metals. The heavy metal resistant ecotype of this species occurs in Poland on zinc-lead waste heaps in the Olkusz ore-mining region. In plants occurring on such polluted soils the mechanisms of resistance against toxic influence of heavy metals have been developed. In this article the mechanism of heavy metal resistance, divided into two main groups — avoiding of and tolerant to heavy metals — in A. maritima are discussed. So far, in this plant the following mechanisms of resistance have been described: (1) at the organism level — immobilization of a great part of heavy metals in roots (with a significant role of root endodermis), accumulation of heavy metals in oldest leaves followed by its fall (detoxification of the aboveground part of plant), accumulation of heavy metals in trichomes and their removal through salt glands of leaf epidermis, (2) at the cellular and ultra structural level — possible role of polyhydroxyphenolic compounds in vacuoles of idioblasts, storage in cell walls and vacuoles (compartmentation), moreover, tolerance mechanisms such as induction of heat shock proteins in cytoplasm

Przystosowania roślin Armeria maritima (Mill.) Willd. do życia na hałdach cynkowo-ołowiowych

Tereny metalonośne, wzbogacone w metale ciężkie w wyników procesów naturalnych lub przemysłowych, są siedliskami o bardzo trudnych warunkach dla wzrostu roślin. Na takich stanowiskach występują metalofity – odmiany, formy, podgatunki i gatunki roślin przystosowane do życia w warunkach nadmiaru metali ciężkich. W populacjach roślin porastających stanowiska metalonośne następuje selekcja, rozwój i utrwalenie mechanizmów zwiększonej odporności na metale oraz na inne czynniki stresowe (susza, deficyt składników odżywczych). Podwyższony poziom odporności na metale ciężkie świadczy o rozwoju tzw. tolerancji indukowanej. W efekcie postępującej adaptacji, osobniki w populacjach na stanowiskach wzbogaconych w metale mogą się znacznie różnić pod względem fenotypowym i genotypowym od osobników tego samego gatunku, żyjących w „normalnych” warunkach. Utrwalone zmiany w obrębie gatunku, zachodzące m. in. w warunkach długotrwałego wzrostu na terenach metalonośnych, prowadzą do powstania nowych form lub taksonów. Procesy te określa się mianem mikroewolucji. Celem pracy było zbadanie przystosowań roślin gatunku Armeria maritima (Mill.) Willd. (Plumbaginaceae L.) do wzrostu na stanowiskach wzbogaconych w metale ciężkie. Na terenie Polski takie stanowiska występują w Olkuskim Okręgu Rudnym. Populacje A. maritima na podłożach metalonośnych są zaliczane do odrębnego podgatunku – A. maritima (Mill.) Willd. subsp. halleri s. l., będącego metalofitem absolutnym. Występowanie tego taksonu jest ściśle związane z terenami o podwyższonym poziomie metali. Natomiast na glebach niemetalonośnych, na obszarze prawie całej Polski, pospolicie występuje podgatunek A. maritima subsp. elongata. Populację roślin A. maritima z terenów cynkowo-ołowiowych w rejonie Olkusza porównano z innymi populacjami, występującymi na stanowiskach metalonośnych i niemetalonośnych. Zbadano poziom odporności roślin A. maritima na ołów, kadm i cynk oraz mechanizmy odporności na poziomie organizmu i na poziomie komórkowym. Istotnym aspektem podjętych badań było ustalenie, czy rośliny A. maritima na terenach cynkowo-ołowiowych w okolicach Olkusza można zaliczyć do podgatunku A. maritima subsp. halleri. Taka klasyfikacja, zaproponowana w 1946 roku przez Władysława Szafera, budziła wątpliwości wynikające głównie z dużego zróżnicowania wyglądu osobników. Dla wyjaśnienia tej kwestii przeprowadzono badania biometryczne roślin oraz badania genetyczne (AFLP). W rezultacie badań stwierdzono bardzo wysoką zawartość ołowiu, kadmu, cynku i talu w podłożach hałd cynkowo-ołowiowych. Rośliny A. maritima rosnące na tych stanowiskach gromadziły duże ilości metali. Największa pula metali była akumulowana w korzeniach, a także w najstarszych, usychających liściach, które zawierały kilkakrotnie więcej metali, niż liście zielone. Zatem, do strategii odpornościowych na poziomie organizmu należało wykluczanie metali ciężkich (przez zatrzymywanie w tkankach korzenia), jak i detoksykacja liści (przez wzbogacenie liści najstarszych, które są odrzucane z rośliny). Zawartość ołowiu w najstarszych liściach roślin rosnących na hałdach przekraczała poziom hiperakumulacji (ponad 1000 mg Pb/kg s. m. pędów). Zbadano poziom odporności (indeks tolerancji) na ołów, kadm i cynk u roślin A. maritma. Przeprowadzono badania roślin w stadium siewek, wyhodowanych z nasion zebranych na stanowisku metalonośnym w rejonie Olkusza oraz na stanowisku niemetalonośnym. Poziom odporności siewek pochodzących z rejonu Olkusza był istotnie podwyższony, co świadczy o rozwoju tolerancji indukowanej w tej populacji. Stężenie metali ciężkich w siewkach obu populacji było podobne. Za podwyższenie poziomu odporności siewek w populacji pochodzącej z terenu metalonośnego odpowiadały lepiej rozwinięte mechanizmy odpornościowe. W korzeniach roślin funkcjonowały dwa mechanizmy detoksykacji: odkładanie metali ciężkich w ścianach komórkowych i magazynowanie metali w wakuolach. Metale ciężkie były wiązane przez związki fenolowe w wakuolach komórek taninowych. W korzeniach siewek populacji z terenu metalonośnego liczba tych komórek była zwiększona, w porównaniu do siewek populacji wrażliwej. Dzięki temu nastąpiło zwiększenie możliwości detoksykacji komórek korzeni. Była to główna przyczyna podwyższenia poziomu odporności siewek w populacji z rejonu Olkusza. Zbadano także mechanizmy odporności na metale ciężkie w liściach roślin dorosłych. Rośliny, pochodzące z nasion zebranych na hałdach cynkowo-ołowiowych oraz na stanowisku niemetalonośnym, hodowano w warunkach laboratoryjnych z dodatkiem Pb2+, Cd2+ i Zn2+. W liściach roślin wszystkich populacji gromadzone były podobne ilości metali ciężkich. Metale były odkładane we włoskach epidermalnych, a ponadto były wydzielane z liści przez gruczoły solne epidermy. Mechanizmy te funkcjonowały w liściach roślin pochodzących z terenów metalonośnych i niemetalonośnych. Jednak wydajność wydzielania ołowiu przez gruczoły solne była wyższa u roślin pochodzących z terenów metalonośnych, w porównaniu do roślin ze stanowiska niemetalonośnego. Ponadto, w miękiszu liści A. maritima licznie występowały komórki taninowe. U roślin hodowanych z dodatkiem Zn2+ stwierdzono nagromadzenie cynku w wakuolach tych komórek. Podsumowując, wykazano, że w populacji roślin A. maritima na terenach cynkowo-ołowiowych w rejonie Olkusza nastąpił rozwój tolerancji indukowanej oraz „wzmocnienie” gatunkowych mechanizmów odporności na ołów, kadm i cynk, zarówno na poziomie organizmu, jak i na poziomie komórkowym. Porównano pod względem morfologicznym rośliny A. maritima porastające stanowiska cynkowo-ołowiowe w rejonie Olkusza z roślinami populacji zasiedlającej hałdę cynkowo-ołowiową w Plombières (Belgia; około 1000 km od Olkusza) oraz kilku populacji na niezanieczyszczonych glebach w Polsce. Populacja w Plombières należy do podgatunku A. maritima subsp. halleri. Ponieważ gatunek A. maritima porasta także podłoża zasolone NaCl (jako halofilny podgatunek A. maritima subsp. maritima), w badaniach uwzględniono dwa stanowiska nadmorskie – w Polsce i w Holandii. W sumie zbadano zmienność morfologiczną roślin w dziewięciu populacjach. Przeprowadzono analizę biometryczną roślin rosnących w warunkach terenowych, a następnie osobników potomnych, które wyhodowano w szklarni z nasion zebranych na wszystkich stanowiskach. Rośliny rosnące na wszystkich stanowiskach cynkowo-ołowiowych były do siebie podobne i różniły się od roślin terenów niezanieczyszczonych. Natomiast rośliny potomne w populacji z rejonu Olkusza wykazywały morfotyp pośredni pomiędzy populacjami stanowisk niemetalonośnych a populacją z Plombières. Wspólnymi, utrwalonymi cechami roślin wszystkich terenów metalonośnych, odróżniającymi je od osobników pozostałych populacji, były: mniejsza długość zewnętrznych listków okrywowych pąka kwiatostanu i mniejsza długość pędu generatywnego. Ostatnim etapem badań było porównanie roślin na stanowiskach metalonośnych i niemetalonośnych pod względem genetycznym, z użyciem markerów molekularnych AFLP. Przeprowadzono badania roślin trzech wybranych populacji (okolice Olkusza, Plombières i stanowisko niemetalonośne w Polsce). Do izolacji DNA wykorzystano dwa zestawy enzymów różniących się wrażliwością na metylację, dzięki czemu równocześnie zbadano polimorfizm sekwencji i wzoru metylacji DNA roślin. Wykazano, że każda z badanych populacji stanowiła odrębny genotyp. Dystans genetyczny między populacjami zależał od rodzaju podłoża, a nie od lokalizacji geograficznej. Wartość dystansu genetycznego pomiędzy populacjami z dwóch stanowisk metalonośnych (Bolesław k/ Olkusza i Plombières; odległość geograficzna około 1000 km) była mniejsza, niż pomiędzy populacjami ze stanowiska metalonośnego i niemetalonośnego w Polsce (odległość geograficzna około 250 km). Pod względem wzoru metylacji DNA, rośliny z rejonu Olkusza były bardziej podobne do roślin z Plombières, niż do tych ze stanowiska niemetalonośnego. W populacjach roślin na dwóch odległych stanowiskach cynkowo-ołowiowych mogły zajść podobne zmiany na poziomie epigenetycznym, pod wpływem metali ciężkich. Wskazuje to, że procesy mikroewolucyjne w populacjach A. maritima na terenach cynkowo-ołowiowych mogą zachodzić z udziałem czynników epigenetycznych. W rezultacie badań wykazano, że populację roślin A. maritima na terenach cynkowo-ołowiowych w rejonie Olkusza można uznać za takson odrębny względem populacji na stanowiskach niezanieczyszczonych metalami, jednak nie jest to A. maritima subsp. halleri. Pod względem genetycznym populacja z okolic Olkusza była odrębna zarówno od populacji z hałdy w Plombières (A. maritima subsp. halleri), jak i od populacji z terenu niezanieczyszczonego (A. maritima subsp. elongata). Zaproponowano, aby populacji A. maritima, porastającej podłoża cynkowo-ołowiowe Olkuskiego Okręgu Rudnego, nadać rangę podgatunku A. maritima subsp. boleslaviensis. Kwestia rangi taksonomicznej tej populacji wymaga dalszych badań, natomiast pewne jest, że stanowi ona unikalny genotyp, warty objęcia ochroną.Soils enriched with heavy metals, both in result of natural processes and industrial activities, are sites very unfavourable for plants’ growth. On such sites one can found metallophytes – varieties, forms, subspecies or species of plants well adapted to growth under the influence of heavy metals. In populations of plants on metalliferous sites one can observe selection, development and establishment of mechanisms of resistance to metals and other stress factors (drought, deficit of mineral nutrients). Increased level of resistance to heavy metals indicates that so-called inducible tolerance has developed. As a result of adaptation, plants in populations growing on metalliferous sites can differ considerably, both on morphological and genetic level, from plants of the same species growing on unpolluted (non-metalliferous) sites. Established differences within the species, observed in populations of plants during long-lasting growth on soils enriched with heavy metals, lead to emergence of new forms or taxons. These processes are called micro-evolutionary changes. The objective of this study was the examination of adaptations of Armeria maritima (Mill.) Willd. (Plumbaginaceae L.) plant species to growth on zinc-lead soils. In the territory of Poland such sites are in the Olkusz Ore-bearing Region. Populations of A. maritima on metalliferous soils are classified as distinct subspecies – A. maritima (Mill.) Willd. subsp. halleri s. l., being an absolute metallophyte. Its occurrence is correlated with soils with elevated level of heavy metals. However, on non-metalliferous soils across the territory of Poland another subspecies – A. maritima subsp. elongata (non-metallophyte) grows commonly. Population of A. maritima on zinc-lead soils in the vicinity of Olkusz was compared with other populations occurring on metalliferous and non-metalliferous soils. The degree of tolerance and mechanisms of tolerance on organism and cellular level were examined. Important aspect of the study was verification of taxonomic status of population of A. maritima on zinc-lead waste heaps in the Olkusz region. Classification of the population as A. maritima subsp. halleri has been proposed by Professor Władysław Szafer in 1946. However, it raised considerable doubts because of large morphological variation of plants. To answer this question, biometric and genetic analyses of plants were performed. For the genetic study AFLP method was applied. Very high concentrations of lead, cadmium, zinc and thallium were found in the substrate of zinc-lead waste heaps. Plants growing on those sites accumulated high amounts of heavy metals. The highest amounts of elements were found in roots and in oldest leaves. Concentration of heavy metals in the oldest leaves was several times higher in comparison to green leaves. Thus, strategies of resistance on the organism level involved: 1) avoiding of transport of metals to leaves by accumulation in roots, and 2) detoxification of aboveground parts by enrichment of the oldest, decaying leaves. Concentration of lead in the oldest leaves exceeded the level of hyperaccumulation (over 1000 mg Pb/kg of dry weight of leaves). Tolerance of A. maritma to lead, cadmium and zinc was examined with the use of Wilkins tolerance index. Study was performed on seedlings cultivated from seeds that were collected in the field – on zinc-lead waste heap near Olkusz and on unpolluted soil. Plants were treated with lead, cadmium and zinc for 9 days. Tolerance index in population of plants originated from the Olkusz region was substantially higher, demonstrating the development of inducible tolerance to heavy metals in this population. Amount of heavy metals in seedlings of both populations after cultivation was similar. Increased tolerance to heavy metals in population originated from zinc-lead waste heaps was due to more effective mechanisms of detoxification. In roots, two mechanisms of detoxification were found: 1) accumulation of metal deposits in cell walls, and 2) storage of metals in cell vacuoles. Heavy metals were bound to phenolic compounds in the vacuoles of so-called tannin cells. Tannin cells were more numerous in roots of plants originated from zinc-lead waste heap in the Olkusz vicinity, in comparison to plants from unpolluted soil. Thus, detoxification processes in roots of plants from zinc-lead waste heap were more effective, resulting in higher tolerance to heavy metals. Mechanisms of tolerance to heavy metals were also examined in leaves of adult plants. Plants originated from seeds collected on zinc-lead waste heaps and on unpolluted site were cultivated under laboratory conditions with the addition of Pb2+, Cd2+ or Zn2+. In leaves of plants of every population similar amounts of metals were accumulated. Metals were localized mainly in trichomes and they were excreted from leaves through salt glands of epidermis. These mechanisms were active in leaves of plants from both polluted and unpolluted sites. However, the efficiency of excretion of lead from leaves of plants from metalliferous soils was higher. Moreover, numerous tannin cells were found in mesophyll of A. maritima leaves. After cultivation of plants with the excess of Zn2+, zinc was accumulated in vacuoles of those cells. Summing up, it was shown that in population of A. maritima from zinc-lead waste heap in the Olkusz region a number of tolerance mechanisms to heavy metals was developed both on the organism and on the cellular level. Armeria maritima plants growing on zinc-lead waste heap in the Olkusz region were compared with those from metalliferous site in Plombières (Belgium; ca 1000 km from Olkusz) and from several unpolluted sites in Poland in respect of morphological differences. Population in Plombières is classified as A. maritima subsp. halleri. Due to a fact that A. maritima can grow on sites enriched with NaCl (as halophytic subspecies A. maritima subsp. maritima), studies were performed also on two coastal sites – in Poland (Rewa) and in Holland (Texel Island). In all, plants in nine populations were studied. Measurements were carried out on plants growing in the field, and then, on progeny of plants cultivated in greenhouse from seeds collected in every site. Plants in populations growing on metalliferous sites were similar to each other and they differed from those occurring on unpolluted sites. However, progeny of plants from the Olkusz region exhibited intermediate character between population from Plombières and those from unpolluted sites in Poland. Common and genetically established traits characteristic for plants from metalliferous sites were: shorter inner involucral bracts of inflorescence bud, and shorter stalks. The last step of studies was the comparison of plants from two zinc-lead heaps (Olkusz region and Plombières) and non-metalliferous one on the genetic level, with the use of molecular markers (amplified fragment length polymorphisms – AFLP). Two enzyme sets were applied for isolation of DNA, enabling simultaneous examination of polymorphism of DNA sequence and DNA methylation pattern. It was shown that every population was a distinct genotype. Genetic distance between pairs of populations was due to the amount of heavy metals in soil, not to geographic distance. Genetic distance between populations from two zinc-lead waste heaps (geographical distance ca 1000 km) was lower, than between those from metalliferous and non-metalliferous site in Poland (geographical distance ca 250 km). In respect of DNA methylation pattern, plants from the Olkusz region were more similar to those from Plombières. In populations of plants on two zinc-lead waste heaps similar changes on the epigenetic level could occur under the influence of heavy metals. This result may indicate that epigenetic processes could play a role in micro-evolutionary changes in populations of A. maritime on metalliferous sites. Summarizing, it was shown that population of A. maritima on zinc-lead waste heaps in the Olkusz Ore-bearing Region is distinct from those growing on unpolluted soils but it can not be classified as A. maritima subsp. halleri. Plants from the vicinity of Olkusz were different from A. maritima subsp. elongata growing on unpolluted soils in Poland and also from A. maritima subsp. halleri inhabiting zinc-lead slag heap in Belgium. Thus, the population from the Olkusz region should be classified neither as A. maritima subsp. elongata nor as A. maritima subsp. halleri. Micro-evolutionary processes in population of Armeria maritima on zinc-lead waste heaps in the Olkusz region led to formation of a distinct phenotype and genotype, development of an induced tolerance to heavy metals and the whole network of tolerance mechanisms. It may be a new Polish subspecies of A. maritima occurring in the Olkusz region – A. maritima subsp. boleslaviensis. Taxonomic classification of this population needs further research. However, its uniqueness is certainly worth of legal protection

Additional file 1: Figure S1. of Overlapping toxic effect of long term thallium exposure on white mustard (Sinapis alba L.) photosynthetic activity

Morphology of white mustard plants grown in the control conditions (A) and in the presence of thallium in concentration 100 μg L−1 (B), 500 μg L−1 (C) and 1,000 μg L−1 (D). Bar = 2.5 cm. Figure S2. Changes of leaf blade architecture of white mustard plants grown in the presence of thallium revealed by bright field microscopy. Pictures show leaf blade cross-sections from control (A) and Tl-treated plants (B-G): 100 μg L−1 (H100) (B); 500 μg L−1 healthy green leaves, which showed no changes in morphology comparing to the control cultivation (H500) (C), green (G500) (D) and yellow (Y500) (E) parts of the affected leaves; 1,000 μg L−1 green (G1000) (F) and yellow (Y1000) (G) parts of the affected leaves. Figure S3. Analysis of non-photochemical quenching parameter (NPQ) in the dark adapted white mustard leaves from control and Tl-treated plants presented on Fig. 3. (A) an exemplary fluorescence traces for control, 500 μg L−1 of Tl and 1,000 μg L−1 of Tl leaves recorded during exposition of dark-adapted leaves to actinic light illumination. (B) Changes of NPQ parameter calculated for the entire leaf area on the basis of recorded fluorescence traces during actinic light illumination. (C) Visualization of the induction and relaxation of NPQ throughout the leaf. The images are representative for at least ten leaves from each treatment. Description of samples abbreviation as given in the legend to Fig. 3. (PDF 629 kb