Expression et rôle des transporteurs ABCG4 et ABCA2 au niveau de la barrière hémato-encéphalique, chez la souris

The blood-brain barrier (BBB) is the main interface separating the central nervous system from the blood, which allows a strict control of the exchanges between the brain and the blood. The BBB is mainly composed of brain capillary endothelial cells (BCECs). Both, the presence of tight junctions between BCECs and efflux transporters on BCECs strongly restrict the passage of endogenous or exogenous molecules through the BBB. The efflux transporters are mainly represented by members of the superfamily of ATP-binding cassette (ABC) proteins. To date, the ABC transporters expressed at the BBB are not all identified or well characterized. This is particularly the case for two lipids transporters, ABCA2 and ABCG4. These transporters seem to be involved in several neurodegenerative diseases, such as Alzheimer's disease (AD). The knowledge of their function at the BBB level might allow identifying physiopathological and/or therapeutic targets. The aim of our work was to characterize these two ABC transporters at the BBB. We first demonstrated using different methods such as RT-qPCR and quantitative targeted absolute proteomics (QTAP) that Abcg4 and Abca2 are both expressed in brain microvessels isolated from mice. Using the in situ brain perfusion technique in mice, we evidenced that Abcg4 and Abca2 are both functional as efflux transporters at the mouse BBB. We identified endogenous substrates (desmosterol and amyloid-beta peptide (AB)) and new inhibitors (probucol, L-thyroxine and estramustine) for Abcg4 at the BBB level. Our data showed that AB is also a substrate for Abca2 and that 17-B-estradiol and estramustine can inhibit the AB efflux mediated by Abca2 at the mouse BBB. Thus, we characterized two new ABC transporters which are deeply involved in the BBB efflux of AB, adding to the two other transporters already identified as being involved in this efflux, namely Abcb1 (P-glycoprotein, P-gp) and Abcg2 (breast cancer resistance protein, Bcrp). These data confirm the cooperation between four transporters at the mouse BBB level to efflux AB out of the brain and evidence that Abca2 and Abcg4 alone mediate at around 80% of the total efflux of AB through the mouse BBB. In conclusion, we characterized Abcg4 and Abca2 at the mouse BBB, which enriched the knowledge of the ABC transporters, expressed at the BBB level and opened new therapeutics possibilities in particular for AD.La barrière hémato-encéphalique (BHE) est la principale barrière séparant le sang du système nerveux central. Elle permet un contrôle strict des échanges entre le cerveau et le sang. La BHE est majoritairement constituée par les cellules endothéliales des capillaires cérébraux, au niveau desquelles sont exprimées des jonctions serrées et des transporteurs membranaires d'efflux qui limitent fortement le passage de molécules endogènes ou exogènes à travers cette barrière. Les transporteurs d'efflux sont principalement représentés par les membres de la superfamille de protéines ATP-binding cassette (ABC). A ce jour, les transporteurs ABC exprimés à la BHE ne sont pas encore tous identifiés ou restent encore peu étudiés. C'est notamment le cas pour deux transporteurs de lipides, qui sont ABCA2 et ABCG4. Ces transporteurs semblent être impliqués dans des pathologies neurodégénératives telle la maladie d'Alzheimer (MA). La connaissance de leurs fonctions au niveau de la BHE pourrait permettre d'identifier des cibles physiopathologiques et/ou thérapeutiques. Ainsi, le but de ce travail de doctorat a été de caractériser ces deux transporteurs ABC à la BHE, chez la Souris. Nous avons tout d'abord démontré l'expression de ces deux transporteurs sur des microvaisseaux isolés de souris par différentes méthodes d'étude dont la qRT-PCR et la protéomique quantitative absolue ciblée (QTAP). Nos études in vivo utilisant la technique de perfusion cérébrale in situ chez la souris nous ont permis de montrer qu'Abcg4 et Abca2 étaient bien fonctionnels au niveau de la BHE, en tant que transporteurs d'efflux. Nous avons identifié des substrats endogènes (desmostérol et peptide béta-amyloïde (AB)) et de nouveaux inhibiteurs d'Abcg4 (probucol, L-thyroxine et estramustine). Nos données montrent que le peptide Aβ est également substrat d'Abca2 et que le 17-B-estradiol et l'estramustine peuvent inhiber l'efflux du peptide AB médié par Abca2 au niveau de la BHE, chez la souris. Ainsi, nos résultats ont permis de caractériser deux nouveaux transporteurs ABC fortement impliqués dans l'efflux cérébral du peptide AB, venant s'ajouter aux deux autres transporteurs identifiés comme étant impliqués dans cet efflux cérébral, à savoir Abcb1 (P-glycoprotéine, P-gp) et Abcg2 (breast cancer resistance protein, Bcrp). L'efflux cérébral d'AB met donc en jeu une coopération entre quatre transporteurs ABC dont les contributions respectives sont de 9%, 13%, 22% et 54% pour Abcb1, Abcg2, Abcg4 et Abca2, montrant qu'Abcg4 et Abca2 permettent à eux seuls l'efflux de près de 80% du peptide AB. En conclusion, grâce à ce travail, nous avons pu caractériser Abcg4 et Abca2 à la BHE de la souris, permettant ainsi de compléter la cartographie des transporteurs ABC fonctionnels à la BHE murine et d'ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques notamment pour la MA

Expression and function of Abcg4 in the mouse blood-brain barrier: role in restricting the brain entry of amyloid-β peptide

Abstract ABCG4 is an ATP-binding cassette transmembrane protein which has been shown, in vitro, to participate in the cellular efflux of desmosterol and amyloid-β peptide (Aβ). ABCG4 is highly expressed in the brain, but its localization and function at the blood-brain barrier (BBB) level remain unknown. We demonstrate by qRT-PCR and confocal imaging that mouse Abcg4 is expressed in the brain capillary endothelial cells. Modelling studies of the Abcg4 dimer suggested that desmosterol showed thermodynamically favorable binding at the putative sterol-binding site, and this was greater than for cholesterol. Additionally, unbiased docking also showed Aβ binding at this site. Using a novel Abcg4-deficient mouse model, we show that Abcg4 was able to export Aβ and desmosterol at the BBB level and these processes could be inhibited by probucol and L-thyroxine. Our assay also showed that desmosterol antagonized the export of Aβ, presumably as both bind at the sterol-binding site on Abcg4. We show for the first time that Abcg4 may function in vivo to export Aβ at the BBB, in a process that can be antagonized by its putative natural ligand, desmosterol (and possibly cholesterol)