Study of the mechanism of the methylating agents induced cell death

The elucidation of the molecular mechanism implicated in cell death following DNA damage induced by anticancer genotoxic agents is crucial for the improvement of chemotherapy effectiveness. Methylating agents constitute a widely used class of anticancer drugs. They target DNA inducing DNA methylation adducts, the most biologically significant being O6-methylguanine (O6-meG) that is repaired by the specific repair enzyme O6-methylguanine DNA methyltransferase (MGMT). Furthermore, there is growing evidence that the molecular mechanism of methylating agent-induced apoptosis and cell death, not fully elucidated yet, is cell type dependent. RNA binding proteins constitute an abundant superfamily of multifunctional proteins. Certain members of this family (specifically hnRNPs) exhibit alterations of their expression during carcinogenesis, a fact related for them being considered as tumour markers. The aim of the present study was to investigate the effect of SΝ1 methylating agents on the cell cycle and on the induced cell death and to examine possible alterations occurring on RNA binding proteins during methylating agent-induced cell death in order to assess their possible use as markers of tumour resistance/sensitivity to chemotherapy. Human cell lines of different origin with varying expression levels of the DNA repair enzyme MGMT, were treated with isotoxic concentrations of N-methyl-N-nitrosourea (MNU), a model SN1 methylating agent. The mechanism of MNU-induced cell death was investigated along with possible modifications of hnRNP proteins. In an MGMT-inducible HeLa Tet-On clonal cell line (cervical carcinoma), cell cycle analysis revealed G2/M arrest followed by induction of apoptosis and dose dependent cell cycle alterations only in cells lacking functional MGMT. Molecular analysis revealed caspase-7 activation and PARP cleavage at late time points. Activation of the mitochondrial pathway in this system was supported by bcl-2 decline and caspase-9 cleavage. Alterations of hnRNP proteins (e.g. C1/C2) were observed upon induction of apoptosis. In A549 (non-small cell lung adenocarcinoma, p53wt) cells, MNU induced G2/M arrest, accompanied by cdc25A degradation, hnRNP B1 induction, hnRNP C1/C2 downregulation. The above findings along with those of the confocal microscopy, which revealed formation of multinucleated cells upon MNU treatment, imply mitotic catastrophe as the mode of cell death. Non-apoptotic cell death was confirmed by the lack of increase in the sub-G1 DNA content, PARP cleavage and caspase-3, -7 activation. In contrast, in H157 (non-small cell lung squamous carcinoma p53null) cells, MNU induced apoptotic cell death, confirmed by confocal microscopy (presence of apoptotic nuclei) cytofluorometry of DNA content and immunodetection of apoptotic markers, accompanied by overexpression of hnRNP B1 and C1/C2. Thus, the mechanism of the cell death induced by SN1 methylating agents is cell type-dependent and must be assessed prior cancer treatment.Η αποσαφήνιση του μοριακού μηχανισμού του κυτταρικού θανάτου που επάγεται από τους αντικαρκινικούς, γονοτοξικούς παράγοντες και τις βλάβες που προκαλούν στο DNA, είναι καθοριστικής σημασίας για την βελτίωση της αποτελεσματικότητας της χημειοθεραπείας. Οι μεθυλιωτικοί παράγοντες, αποτελούν μια ευρέως χρησιμοποιούμενη κατηγορία αντικαρκινικών φαρμάκων. Προκαλούν μεθυλιωτικές βλάβες στο DNA, με πιο σημαντική από βιολογική άποψη την O6 μεθυλογουανίνη (O6-meG), η οποία επιδιορθώνεται από το ειδικό επιδιορθωτικό ένζυμο DNA-μεθυλοτρανσφεράση της O6 μεθυλογουανίνης (MGMT). Επιπλέον, συνεχώς αυξανόμενα δεδομένα υποστηρίζουν ότι ο μοριακός μηχανισμός του επαγόμενου κυτταρικού θανάτου από τα μεθυλιωτικά- ο οποίος ακόμα δεν έχει πλήρως διαλευκανθεί - εξαρτάται από τον κυτταρικό τύπο. Οι πρωτεΐνες με ικανότητα πρόσδεσης RNA, αποτελούν μια υπεροικογένεια πολυλειτουργικών πρωτεϊνών. Ειδικότερα, οι ετερογενείς πυρηνικές ριβονουκλεοπρωτεΐνες (hnRNPs) -μέλη αυτής της υπεροικογένειας- εμφανίζουν αλλαγές στην έκφρασή τους κατά τη διάρκεια της καρκινογένεσης. Το γεγονός αυτό τις κατατάσσει στους πιθανούς καρκινικούς δείκτες. Στόχος της παρούσας διατριβής, ήταν η μελέτη της επίδρασης των μεθυλιωτικών παραγόντων SN1 τύπου στον κυτταρικό κύκλο και στον μηχανισμό κυτταρικού θανάτου σε διάφορους κυτταρικούς τύπους και η μελέτη των αλλαγών των πρωτεϊνών της μετα-μεταγραφικής μηχανής με ικανότητα πρόσδεσης RNA, κατά την διάρκεια του επαγόμενου από μεθυλιωτικούς παράγοντες κυτταρικού θανάτου με στόχο την διερεύνηση της δυνητικής χρήσης τους ως δείκτες χημειοευαισθησίας. Χορηγήθηκαν ισοτοξικές δόσεις του πρότυπου μεθυλιωτικού παράγοντα SN1 τύπου, MNU (N-μέθυλο-Ν-νιτροδουρία) σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές διαφορετικής προέλευσης οι οποίες εμφανίζουν ποικίλα επίπεδα έκφρασης του ενζύμου MGMT. Διερευνήθηκε ο μηχανισμός του επαγόμενου κυτταρικού θανάτου, μαζί με πιθανές αλλαγές σε hnRNP πρωτεΐνες. Στην κλωνική κυτταρική σειρά HeLa Tet-On (καρκίνωμα τραχήλου) στην οποία η έκφραση της MGMT μπορεί να επαχθεί, η ανάλυση κυτταρικού κύκλου έδειξε G2/M στάση, ακολουθούμενη από επαγωγή απόπτωσης και δοσοεξαρτώμενες αλλαγές στον κυτταρικό κύκλο, μόνο σε κύτταρα χωρίς λειτουργική MGMT. H ανάλυση σε μοριακό επίπεδο, έδειξε πρωτεολυτική ενεργοποίηση της κασπάσης-7 και πρωτεολυτική πέψη της PARP σε προχωρημένα χρονικά σημεία. Η υπόθεση ενεργοποίησης του μιτοχονδριακού μονοπατιού σε αυτό το κυτταρικό σύστημα, ενισχύθηκε από την μείωση των επιπέδων της Bcl-2 αλλά και την πέψη της κασπάσης-9. Επιπλέον, ανιχνεύθηκαν αλλαγές σε hnRNP πρωτεΐνες (πχ hnRNP C1/C2) κατά την επαγωγή απόπτωσης. Στα Α549 (μη μικροκυτταρικό αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα, p53wt), η MNU προκάλεσε G2/M στάση, η οποία συνοδεύτηκε από αποδόμηση της cdc25A, επαγωγή της hnRNP B1 και μείωση των επιπέδων της hnRNP C1/C2..

Modulation of Pathways Underlying Distinct Cell Death Mechanisms in Two Human Lung Cancer Cell Lines in Response to S_N1 Methylating Agents Treatment

Modulation of Pathways Underlying Distinct Cell Death Mechanisms in Two Human Lung Cancer Cell Lines in Response to S_N1 Methylating Agents Treatmen

Validation of Microarray data.

<p><b>(a)</b> Validation of microarray data by RT-PCR. Fold change in expression (in log₂ scale) of the selected genes, as compared between MNU and DMSO treated cells, as mentioned by qRT-PCR and microarrays. Values represent the mean of three independent reactions and error bars the standard deviations. <i>GAPDH</i> was used as an internal control for data normalization. All expressions were statistically significantly different between MNU and DMSO treated cells, except those of ERCC1 which was used as internal control. <b>(b)</b> Immunoblot of A549 cell extracts (40 μg) with a-caspase-1 antibody. Cells were either DMSO (0.1% v/v) or MNU (200 μg/ml) treated and maintained in culture for the indicated length of time. The relative abundance of total protein applied was measured by using as control the amount of actin as assessed by a-actin on the same blot.</p

Top up- and down-regulated genes in A549 cells after MNU treatment.

<p>Top up- and down-regulated genes in A549 cells after MNU treatment.</p

Statistically significant differentiated genes.

<p>Hierarchical clustering of the expression fold change values, as compared between MNU and DMSO treated cells after 24, 48 and 72h of treatment. The genes found as significantly differentiated in A549 <b>(a)</b> and H157 cells <b>(b)</b> are shown, where red color indicates up-regulated genes and green indicates down-regulated genes. <b>(c)</b> Venn diagram showing the total number of genes found as significantly differentiated in A549 and H157 cells, after MNU treatment. Among the 87 common genes, 63 share a common expression profile (up- or down-regulation) in both cell lines.</p

StRAnGER pathway analysis.

<p>StRAnGER pathway analysis exploiting KEGG database, based on the up-regulated genes after MNU-treatment in A549 cells. The P53 signaling pathway is ranking at the top of the significantly over-represented pathways. Genes found as significantly up-regulated are shown in red.</p