Epigenetic reprogramming by TET enzymes impacts co-transcriptional R-loops

PTDC/BIA-MOL/30438/2017 PTDC/MED-OUT/4301/2020 RiboMed 857119 PD/BD/128292/2017 LCF/PR/HP21/52310016 PTDC/BIA-MOL/6624/2020 PTDC/MED-ONC/7864/2020DNA oxidation by ten-eleven translocation (TET) family enzymes is essential for epigenetic reprogramming. The conversion of 5-methylcytosine (5mC) into 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) initiates developmental and cell-type-specific transcriptional programs through mechanisms that include changes in the chromatin structure. Here, we show that the presence of 5hmC in the transcribed gene promotes the annealing of the nascent RNA to the template DNA strand, leading to the formation of an R-loop. Depletion of TET enzymes reduced global R-loops in the absence of gene expression changes, whereas CRISPR-mediated tethering of TET to an active gene promoted the formation of R-loops. The genome-wide distribution of 5hmC and R-loops shows a positive correlation in mouse and human stem cells and overlap in half of all active genes. Moreover, R-loop resolution leads to differential expression of a subset of genes that are involved in crucial events during stem cell proliferation. Altogether, our data reveal that epigenetic reprogramming via TET activity promotes co-transcriptional R-loop formation, disclosing new mechanisms of gene expression regulation.publishersversionpublishe

Mechanisms of Hexavalent Chromium Carcinogenicity: Effects on the Stress Response and on the Genomic Stability of the BEAS-2B Cell Line

ABREU, Patrícia Alexandra Lona - Mechanisms of Hexavalent Chromium Carcinogenicity: Effects on the Stress Response and on the Genomic Stability of the BEAS-2B Cell Line. Coimbra : [s.n.], 2016. Dissertação de Mestrado.Hexavalent chromium [Cr(VI)] has long been recognized as an occupational lung carcinogen. However, despite several studies, the molecular basis of Cr(VI)-induced carcinogenesis remains essentially elusive. This elusiveness can be, at least partially, attributed to the use, in many of those studies, of experimental models and exposure regimens that are of questionable biological relevance. Activation of the stress response and genomic instability have been proposed to have important roles in cancer development and progression, but little is known about the role they might play in Cr(VI)-induced carcinogenesis. To gain some insight on this topic, the effects of a short-term exposure to Cr(VI) on the stress response and of a long-term exposure on genomic stability were investigated in the present study. To address the question of biological relevance, the BEAS-2B cell line, a cellular model representative of the human bronchial epithelium, which is the main target of Cr(VI) carcinogenity in vivo, was used. Initially, the impact of the culturing conditions and the culture age on the growth characteristics and genomic stability of this cell line was evaluated. All modifications of the culturing conditions tested in this study, as well as the culture age, induced some alterations to the morphology and growth pattern of BEAS-2B cells. The culture age also had a significant impact on the chromosomal complement of these cells. A short-term exposure of BEAS-2B cells to Cr(VI) conferred a certain resistance against the inhibitory effect on proliferation produced by an acute heat shock. This resistance cannot be explained by alterations in the cellular energy status, nor, apparently, through elevated protein levels of key components of the stress response. In fact, the impact of Cr(VI) on the intracellular levels of the heat shock proteins 90α (Hsp90α) and 72 (Hsp72) and of the heat shock factor 1 (HSF1) was evaluated and the only significant effect observed was a decrease in the levels of Hsp90α. At the mRNA level, Cr(VI) caused a decrease in the levels of HSPA1A, which encodes Hsp72. In addition, the impact of Cr(VI) on the mRNA levels of some components of cancer-associated pathways also related to the stress response was investigated and alterations were observed in the levels of ATM and ATR, which encode important components of the DNA damage response. The mRNA levels of ATM were decreased, while those of ATR were increased.A long-term exposure to Cr(VI), for over eight months, did not induced genomic instability nor morphological alterations, suggesting that no neoplastic transformation occurred.O crómio hexavalente [Cr(VI)] foi há muito reconhecido como agente cancerígeno pulmonar. Contudo, apesar dos diversos estudos já realizados, ainda muito pouco se sabe sobre a base molecular da carcinogénese induzida pelo Cr(VI). Isto deve-se, em parte, ao facto de muitos desses estudos terem usado modelos experimentais e regimes de exposição cuja relevância biológica é questionável. A ativação da resposta ao stress e a instabilidade genómica parecem ter importantes papéis no desenvolvimento e progressão do cancro, mas pouco se sabe o sobre o papel que poderão ter no contexto da carcinogénese induzida pelo Cr(VI). Para tentar obter alguma informação sobre este assunto, neste estudo foram investigados os efeitos de uma exposição de curta duração a Cr(VI) na resposta ao stress e os de uma exposição de longa duração na estabilidade genómica. Tendo em consideração a questão da relevância biológica, usou-se nesta investigação a linha celular BEAS-2B, um modelo representativo do epitélio brônquico humano, que é o principal alvo da ação carcinogénica do Cr(VI) in vivo. Inicialmente, o impacto das condições e idade da cultura na morfologia, padrão de crescimento e estabilidade genómica desta linha celular foi avaliado. Todas as alterações às condições de cultura testadas neste estudo, bem como a idade da cultura, induziram algumas alterações na morfologia e padrão de crescimento das células BEAS-2B. A idade da cultura teve também um impacto significativo no complemento cromossómico destas células. Uma exposição de curta duração de células BEAS-2B a Cr(VI) conferiu uma certa resistência à inibição da proliferação causada por um choque térmico de curta duração. Esta resistência não pode ser explicada por alterações no estado energético celular, nem, aparentemente, por um aumento nos níveis de alguns componentes-chave da resposta ao stress. De facto, o impacto do Cr(VI) nos níveis intracelulares das proteínas do choque térmico 90α (Hsp90α) e 72 (Hsp72) e do factor de choque térmico 1 (HSF1) foi avaliado e o único efeito significativo observado foi uma diminuição nos níveis da Hsp90α. Em termos de níveis de mRNA, o Cr(VI) causou uma diminuição dos níveis de HSPA1A, que codifica a Hsp72. Além disto, o impacto do Cr(VI) nos níveis de mRNA de alguns elementos associados com a carcinogénese e também relacionados com a resposta ao stress foi investigado e observaram-se alterações nos níveis de ATM e ATR, que codificamcomponentes envolvidos nos mecanismos de reposta a danos no DNA. Os níveis de mRNA de ATM sofreram uma diminuição, enquanto os de ATR aumentaram. Uma exposição de longa duração, durante mais de oito meses, a Cr(VI) não induziu instabilidade genómica nem alterações morfológicas, o que sugere que não ocorreu transformação neoplásica