Comparison of phenotypic and genotypic diagnosis of acute human bocavirus 1 infection in children

Background: Diagnosis of human bocavirus 1 (HBoV1) has been based on qualitative PCRs detecting HBoV1 DNA or detection of HBoV1 mRNA. Objective: This study aims to assess whether a rapid and automated HBoV1 antigen test is suitable for diagnosis of acute HBoV1 infection. Study design: HBoV1 antigen detection has been compared with quantitative HBoV1 DNA PCR and HBoV1 mRNA RT-PCR. Results and conclusion: We conclude that HBoV1 antigen detection has higher clinical specificity and positive predictive value than HBoV1 DNA qualitative PCRs, yet a lower sensitivity than HBoV1 mRNA detection. Additionally, HBoV1 antigen detection is beneficial in its rapidity and availability as a point-of-care test.Peer reviewe

Kvantitatiivisen RT-PCR -menetelmän validointi Parechovirusten tunnistamiseksi

Parechovirukset ovat sekä ihmisiä että eläimiä infektoivia pieniä RNA-viruksia. Vaikka 95 % aikuisista Suomessa kantaa viruksen vasta-aineita, on parechovirusinfektioita tutkittu vasta viime vuosina. HPeV-infektio sairastetaan useimmiten alle yksivuotiaana. Infektio voi olla oireeton, aiheuttaa lieviä suolisto- ja hengitystieoireita tai johtaa vakaviin tulehdustiloihin, kuten aivokalvontulehdukseen. Parechovirustartunta voidaan tunnistaa uloste-, nenänielu- tai likvor-näytteestä nopeasti ja luotettavasti RT-qPCR –menetelmällä. HPeV-infektion diagnosointiin kehitetty menetelmä on tarkoitus ottaa käyttöön Turun yliopiston UTULab-diagnostiikkalaboratoriossa. Laboratorion akkreditiointi edellyttää kuitenkin uusien menetelmien validointia ennen käyttöönottoa. Opinnäytetyön tavoitteena oli optimoida ja validoida HPeV RT-qPCR –menetelmä, jotta se voidaan ottaa osaksi UTULabin tarjoamaa tutkimusvalikoimaa. RT-qPCR –menetelmille ei ole julkaistu selkeitä validointiohjeita, joten osana työtä oli validointisuunnitelman laatiminen. Validoitaviksi parametreiksi valittiin analyyttinen spesifisyys, herkkyys, toistotarkkuus, oikeellisuus sekä lineaarisuus ja määritysalue. RT-reaktio, qPCR-reaktiossa käytettävä alukepari ja PCR-tuotteen leimausmenetelmä optimoitiin ennen validointia. Validoitavaan menetelmään valittiin testiajojen perusteella Fermentaksen RT-reaktion reagenssit ja K30-aluke sekä qPCR-reaktioon julkaisematon forward-aluke ja SYBR Green –leima. Validointiajoilla todettiin, että menetelmä antaa positiivisen tuloksen eri lähteistä eristetyille HPeV-näytteille sekä negatiivisen tuloksen enteropositiivisille näytteille sekä näytematriiseille. Menetelmän herkkyydeksi saatiin 101-100 K/µl ja lineaariseksi alueeksi 101-104 K/µl. Menetelmän toistotarkkuus ja oikeellisuus olivat hyväksyttävissä rajoissa. qPCR-reaktion keskimääräinen tehokkuus oli 87 %. Validointiajojen perusteella RT-qPCR –menetelmä parechovirusten tunnistamiseksi on riittävän luotettava, herkkä sekä toistettava otettavaksi diagnostiseen käyttöön.Parechoviruses are small RNA viruses which can infect both humans and animals. Even though 95 % of adults in Finland carry parechovirus antibodies, HPeV infections have only been studied in recent years. HPeV infections are commonly found in children aged up to one year. The infection can be asymptomatic, cause mild gastrointestinal and respiratory symptoms, or result in a severe inflammation such as meningitis. With the RT-qPCR method, an HPeV infection can rapidly and reliably be identified from a nasopharyngeal, stool or cerebrospinal fluid sample. The method will be used in the UTULab diagnostic laboratory of Turku University. The accreditation of the diagnostic laboratory requires the validation of new diagnostic methods. The aim of this thesis was to optimize and validate the HPeV RT-qPCR method in order for it to be offered as one of UTULab’s diagnostic services. As general instructions for the validation of RT-qPCR have not been published, the validation instructions were prepared as part of the thesis project. Analytical specificity, sensitivity, precision, accuracy, linearity and range were selected as the parameters for the validation. Before validation, the RT reaction method, the primer pair to be used in the qPCR reaction, and the labeling method of the PCR product were optimized. The best results were achieved by using RT reagents by Fermentas and reverse primer K30 and an unpublished forward primer in the qPCR reaction with an SYBR Green label. By validation runs, the method was shown to give positive results to samples with parechovirus from different sample sources and negative results to enterovirus positive samples and template free sample matrices. The sensitivity of the method was determined as between 101 and 100 copies/µl and the linearity of the method as 101-104 copies/µl. The precision and accuracy of the method were acceptable. The average efficiency of the qPCR reaction was 87 %. The validation verified that the RT-qPCR method for the detection of parechoviruses is reliable, sensitive and reproducible enough to be used as a diagnostic tool.Osa opinnäytetyötä on luokiteltu salassa pidettäväksi