Χρήση Χρωματογραφίας Κατ’ Αντιρροή Για Την Παραλαβή Βιοδραστικών Συστατικών Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Από Εκχυλίσματα Γεντιανής Και Προϊόντων Ελιάς.

Αντικείμενο μελέτης αποτέλεσε η Χρωματογραφία Κατανομής με Φυγοκέντρηση, η οποία είναι μία σύγχρονη τεχνική για την επεξεργασία και κλασμάτωση πολύπλοκων εκχυλισμάτων και την παραλαβή καθαρών μεταβολιτών, τόσο του πρωτογενή όσο και του δευτερογενή μεταβολισμού των φυτικών οργανισμών. Με την εφαρμογή της τεχνικής αυτής έγινε δυνατή η ανάπτυξη κατάλληλης μεθόδου για την παραλαβή καθαρών μεταβολιτών, ανάλογα τις ιδιότητες του εκχυλίσματος και του μεταβολίτη στόχου. Επιλέχθηκαν 2 διαφορετικά φυτικά υλικά, η γεντιανή (Gentiana lutea) και η ελιά (Olea europaea), καθώς είναι πλούσια σε βιοδραστικούς μεταβολίτες με αξιοσημείωτες φαρμακολογικές ιδιότητες. Πρωταρχικός στόχος της διπλωματικής εργασίας ήταν η επεξεργασία του μεθανολικού εκχυλίσματος ρίζας γεντιανής για την γρήγορη και αποτελεσματική απομόνωση του δραστικού μεταβολίτη γεντιοπικροσίδη με την χρήση όσο το δυνατό πιο εξελιγμένων εργαστηριακών μεθόδων. Έτσι, το εκχύλισμα πλούσιο σε γεντιοπικροσίδη αναλύθηκε αρχικά με την μέθοδο C.P.E., ώστε να μειωθεί ο χρόνος επεξεργασίας και προέκυψαν συνολικά 10 εμπλουτισμένα κλάσματα. Η περαιτέρω ανάλυση των εμπλουτισμένων κλασμάτων με την τεχνική παρασκευαστική HPLC οδήγησε στην παραλαβή γεντιοπικροσίδη σε μεγάλη καθαρότητα. Παράλληλα με την υλοποίηση του πρωταρχικού στόχου, επιτεύχθηκε και μια πιο λεπτομερής φυτοχημική ανάλυση του ολικού εκχυλίσματος από την οποία έγινε δυνατή η παραλαβή και ταυτοποίηση 6 κύριων μεταβολιτών του εκχυλίσματος (Γεντισίνη, Ισογεντισίνη, Ισογεντισινη-3-Ο-Πριμεβεροσίδης, Ισογεντισινη-7-Ο-Πριμεβεροσίδης, Σβερτιαμαρίνη και Λογανικό Οξύ). Εξίσου σημαντικός στόχος της παρούσας εργασίας ήταν η γρήγορη και αποτελεσματική απομόνωση ολεανολικού και μασλινικού οξέος από προϊόντα ελιάς με την χρήση σύγχρονων χρωματογραφικών μεθόδων. Το ολεανολικό και μασλινικό οξύ αποτελούν δύο βιοδραστικά τριτερπενικά οξέα με πληθώρα βιολογικών δράσεων. Οι διαχωριστικές πορείες ,που επιλέχτηκαν περιλαμβάνουν σαν κύριο στάδιο τη χρήση της Χρωματογραφίας Κατ΄ Αντιρροή με την εφαρμογή της μεθόδου pH-zone refining. Η μέθοδος αυτή εκμεταλλεύεται την όξινη φύση των δύο τριπερπενίων και κυρίως την ιδιότητά τους να μεταβάλουν δραματικά τον συντελεστή κατανομής στις δύο φάσεις ενός διφασικού συστήματος ανάλογα του pH του συστήματος. Το δείγμα, που επιλέχθηκε για την απομόνωση του ολεανολικού οξέος είναι το απολιπασμένο κλάσμα του ακετονικού εκχυλίσματος των φύλλων ελιάς. Το κλάσμα αυτό, πέραν των λιπαρών ενώσεων και των χλωροφυλλών που περιέχει, αποτελεί και πλούσια πηγή ολεανολικού οξέος. Η πορεία διαχωρισμού που επιλέχτηκε περιλαμβάνει αρχικά την επεξεργασία του εκχυλίσματος με ζωικό άνθρακα ώστε να απομακρυνθεί ο μεγάλος όγκος χλωροφυλλών και στη συνέχεια, την ανάλυση του κλάσματος με pH-Zone refining C.P.E., που οδήγησε στην απομόνωση καθαρού ολεανολικού οξέος. Το ολικό πολυφαινολικό κλάσμα του ελαιολάδου περιέχει σημαντικές βιοδραστικές ουσίες διαφόρων χημικών κατηγοριών και είναι πλούσια πηγή σε μασλινικό οξύ. Η διαδικασία απομόνωσης του μασλινικού οξέος από το κλάσμα του ελαιολάδου περιλαμβάνει τη χρήση της Χρωματογραφίας Κατ΄ Αντιρροή με εφαρμογή δύο διαφορετικών μεθόδων. Αρχικά, το εκχύλισμα κλασματώθηκε με dual-mode CPE και στη συνέχεια, το εμπλουτισμένο στον μεταβολίτη, κλάσμα αναλύθηκε με pH-zone refining C.P.E για την παραλαβή καθαρού μεταβολίτη. Παράλληλα, σημαντικό μέρος διπλωματικής εργασίας αποτέλεσε η ανάλυση του Ολικού Πολυφαινολικού Κλάσματος με την μέθοδο gradient mode C.P.C., όπου εξασφαλίζεται η παραλαβή εμπλουτισμένων κλασμάτων με έντονο χημικό ενδιαφέρον. Η επεξεργασία τριών εξ’ αυτών των κλασμάτων οδήγησε στην απομόνωση τριών νέων μεταβολιτών. Η ανάλυση του κλάσματος 19 με την μέθοδο παρασκευαστική TLC οδήγησε στην απομόνωση μίας ουσίας με παρόμοια χημική δομή με την ολεοκανθάλη, η οποία ταυτοποιήθηκε ως Ολεοκανθαλικό Οξύ. Με παρασκευαστική HPLC αναλύθηκε το κλάσμα 21, από όπου προέκυψε ουσία με παρόμοια δομή με την Ολεασείνη και χαρακτηρίστηκε ως Ολεασεινικό Οξύ. Τέλος, παρόμοια επεξεργάστηκε το κλάσμα 27, που οδήγησε στην απομόνωση του Eda Acid, το οποίο ενώ έχει απομονωθεί από προϊόντα ελαιοτριβείων, είναι η πρώτη φορά που αναφέρθηκε στο ελαιόλαδο. Τελευταίο πειραματικό κομμάτι της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι ο έλεγχος της αντιοξειδωτικής δράσης των απομονωμένων μεταβολιτών του ελαιολάδου μέσω της εφαρμογής του πρωτοκόλλου DPPH. Από τα αποτελέσματα λήφθηκαν αξιόλογα συμπεράσματα που συνδέουν την εμφάνιση δράσης μίας ουσίας με την ύπαρξη του χαρακτηριστικού δακτυλίου κατεχόλης στο μόριο της.The subject of this study is the application of the Counter-Current Chromatography, which is a modern technique of process and separation complex extracts and isolation pure metabolites of both primary and secondary metabolism of plants. By applying this technique, it has been possible to develop an appropriate method for obtaining pure metabolites depending on the properties of the extract and the metabolite. Two different plant materials, Gentiana lutea and Olea europaea, were chosen, as they are rich in bioactive metabolites with remarkable pharmacological properties. The primary objective of this thesis was the processing of methanol extract of gentian root for the rapid and efficient isolation of the active metabolite gentiopicroside using the most current laboratory methods. Thus, the extract rich in gentiopicroside, was first analyzed by the C.P.E. method to reduce processing time and a total of 10 enriched fractions were obtained. Further analysis of the enriched fractions with preparative HPLC was obtained gentiopicroside in high purity. These two techniques use a different mechanism and their combination in the same separation process can ensure a more efficient purification of the target. Along with the achievement of the primary objective, a more detailed phytochemical analysis of the total extract was happened, from which it was possible to obtain and identify 6 major metabolites of the extract. (Gentisin, Isogentisin, Isogentisin-3-O-Primeveroside, Isogentisin-7-O-Primeveroside, Swertiamarin and Loganic Acid) An equally important aim of the present work was the rapid and efficient isolation of Oleanolic and Maslinic Acid from olive products using modern chromatographic methods. Oleanolic and maslinic acid are two bioactive triterpenic acids with a variety of biological activities. The separation procedure included the use of Centrifugal Partition Chromatography as the main step by applying the pH-Zone refining method. This method exploited the acidic nature of the two triterpenes and, in particular, their ability to dramatically modification the coefficient partition in the two phases of a two-phase system according to the pH of the system. The acetonic extract of the olive leaves, in addition to the fatty compounds and chlorophylls, is also a rich source of oleanolic acid. The separation involved treating of the extract with charcoal to remove the large volume of chlorophylls and then, the fraction was analyzed by pH-Zone refining C.P.E., which led to the isolation of pure oleanolic acid. The total polyphenolic fraction of olive oil contains important bioactive substances of various chemical categories and is a rich source of maslinic acid. The isolation of maslinic acid from the olive oil fraction involved the use of Chromatography Partition Chromatography by applying two different methods. Initially, the extract was fractionated with dual-mode CPE and then the fraction enriched in the metabolite was analyzed by pH-Zone refining C.P.E to obtain pure maslinic acid. Furthermore, a significant part of this thesis was the analysis of the Total Polyphenol Fraction (T.P.F.) by gradient mode C.P.C., which ensured the intake of enriched fractions with high chemical interest. The treatment of these fractions led to the isolation of three new metabolites. Analysis of fraction 19 by the preparative TLC method led to the isolation of a compound with a similar chemical structure to oleocanthal, which was identified as Oleocanthalic Acid. By applying preparative HPLC, fraction 21 was analyzed to give a compound similar in structure to oleacein and was elucidated as Oleaceinic Acid. Finally, a similar procedure in fraction 27 led to the isolation of Eda Acid, which, while had been isolated from olive oil products, is the first time to be mentioned in olive oil. The last experimental part of this thesis was the control of the antioxidant activity of the isolated metabolites of olive oil through the application of the DPPH protocol. The results obtained remarkable conclusions linking the action of the compound with the presence of the catechol moiety in the molecule

Σύγχρονες προσεγγίσεις στη φαρμακογνωστική μελέτη παραδοσιακών θεραπευτικών φυτών της οικογένειας Oleaceae

The main goal of this doctoral thesis is the phytochemical investigation of significant medicinal species of the Oleaceae family through modern scientific approaches both in terms of methodology and the application of specialized techniques. Olive (Olea europaea) is the most abundant tree in the Mediterranean basin. Its importance is not observed only in nutritional and economic field but also in the promotion of human health, through its biologically active molecules. The development of effective methodologies using "green" techniques for the isolation of bioactive metabolites in large quantities and high purity from olive products will be the initial goal of this study. The decryption of the chemical composition of olive oil, as well as the correlation of various metabolites with its quality is of great importance. Despite the plethora of scientific studies, there is a class of secondary metabolites in olive oil, the acidified secoiridoid derivatives that remain relatively unknown. Within the framework of this proposal, integrated protocols will be formulated for the semi-synthesis of these derivatives and the correlation of these molecules with quality parameters of olive oil will be evaluated. On the other hand, the high complexity of the active mixtures of both olive products and herbal extracts makes difficult the attempt to discover new active molecules through traditional methods. Thus, the purpose of the thesis will be the development of an appropriate method, using modern metabolic tools, for the identification of active metabolites of both the phenolic fraction of olive oil and its oxidized form. Finally, endemic plants of genus Fraxinus have a similar phytochemical content with olive and have been widely used in traditional and modern medicine. These species will be further studied in order to exploit them more effectively.Αντικείμενο της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτελεί η φαρμακογνωστική μελέτη σημαντικών φαρμακευτικών ειδών της οικογένειας Oleaceae μέσω σύγχρονων επιστημονικών προσεγγίσεων τόσο σε επίπεδο μεθοδολογίας όσο και στη χρήση εξειδικευμένων τεχνολογιών. Η ελιά (Olea europaea) αποτελεί τον πλέον άφθονο φυτικό είδος στη λεκάνη της Μεσογείου. Η σημαντικότητα της δεν εντοπίζεται μόνο στον διατροφικό και οικονομικό τομέα αλλά και στην προαγωγή της ανθρώπινης υγείας, μέσω των βιολογικά ενεργών χημικών μορίων που περιέχει. Η ανάπτυξη αποτελεσματικών μεθοδολογιών με χρήση «πράσινων» τεχνικών για την παραλαβή βιοδραστικών μεταβολιτών σε μεγάλη ποσότητα και υψηλή καθαρότητα από προϊόντα ελιάς, θα αποτελέσει τον αρχικό στόχο της παρούσας μελέτης. Μεγάλο ενδιαφέρον παρουσιάζει και η αποκρυπτογράφηση της χημικής σύστασης του ελαιόλαδου, καθώς και η συσχέτιση διαφόρων μεταβολιτών με την ποιότητα του. Πάρα την πληθώρα των επιστημονικών μελετών, υπάρχει μια κατηγορία δευτερογενών μεταβολιτών στο ελαιόλαδο, τα οξειδωμένα παράγωγα σεκοϊριδοειδών, που παραμένουν σχετικά άγνωστα. Στα πλαίσια της διατριβής, θα αναπτυχθούν ολοκληρωμένα πρωτοκόλλα για την ημισύνθεση των παραγώγων αυτών και θα γίνει προσπάθεια συσχέτισης τους με χαρακτηριστικά ποιότητας του ελαιόλαδου. Από την άλλη, η πολυπλοκότητα των δραστικών μιγμάτων τόσο των προϊόντων ελιάς όσο και γενικότερα των φυτικών εκχυλισμάτων καθιστούν δύσκολη την ανακάλυψη νέων δραστικών μορίων μέσω των παραδοσιακών μεθόδων. Έτσι, αντικείμενο της διατριβής θα αποτελέσει η ανάπτυξη κατάλληλης μεθόδου, με χρήση σύγχρονων μεταβολομικών εργαλείων, για την ταυτοποίηση δραστικών μεταβολιτών τόσο του φαινολικού κλάσματος του ελαιόλαδου όσο και της οξειδωμένης μορφής του. Τέλος, ενδημικά είδη του γένους Fraxinus παρουσιάζουν παρόμοιο φυτοχημικό προφίλ με την ελιά και έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως στη λαϊκή και σύγχρονη θεραπευτική. Τα είδη αυτά θα μελετηθούν περαιτέρω με σκοπό την αποτελεσματικότερη εκμετάλλευση τους

Phytochemical Analysis and Dermo-Cosmetic Evaluation of Cymbidium sp. (Orchidaceae) Cultivation By-Products

Cymbidium is one of the most popular genera in Orchidaceae family, commercialized either as loose flowers or as potted plants in floriculture worldwide. The non-marketable parts are typically discarded (e.g., unsuitable flowers, leaves, pseudobulbs, roots), generating an enormous quantity of unutilized biomass. The above by-products were studied through phytochemical analysis and investigated for their dermo-cosmetic potential. The initial antioxidant, anti-tyrosinase, anti-elastase, and anti-collagenase assays of the total extracts indicated that the pseudobulb and root ethyl acetate extracts were the most potent. Those extracts were then submitted to chromatographic separation leading to the isolation of 16 secondary metabolites (four phenanthrenes, three 1,4-phenanthrenquinones, three dibenzyls, two phenolic acid derivatives, two sterols, one dehydrodiconiferyl alcohol derivative, and one simple phenolic compound), including 6-hydroxy-5,7-dimethoxy-1,4-phenanthrenequinone (cymbisamoquinone), which was identified as a new natural product. In parallel, 48 metabolites were identified by UPLC-HRMS analysis of the extracts. The biological evaluation of the isolated compounds revealed that gigantol and tristin present important anti-tyrosinase activity, while bulbophyllanthrin, 3-hydroxy-2,4,7-trimethoxy-phenanthrene, marylaurencinol A, 5-hydroxy-2-methoxy-1,4-phenanthrenequinone, and ephemeranthroquinone B show dose-dependent anti-collagenase activity. In contrast to isolated metabolites, which may act selectively on specific enzymes, the initial total extracts exhibited inhibitory activity against tyrosinase, elastase, and collagenase enzymes, thus showing better prospects for use in dermo-cosmetic formulations

Phytochemical Analysis and Dermo-Cosmetic Evaluation of Cymbidium sp. (Orchidaceae) Cultivation By-Products

Cymbidium is one of the most popular genera in Orchidaceae family, commercialized either as loose flowers or as potted plants in floriculture worldwide. The non-marketable parts are typically discarded (e.g., unsuitable flowers, leaves, pseudobulbs, roots), generating an enormous quantity of unutilized biomass. The above by-products were studied through phytochemical analysis and investigated for their dermo-cosmetic potential. The initial antioxidant, anti-tyrosinase, anti-elastase, and anti-collagenase assays of the total extracts indicated that the pseudobulb and root ethyl acetate extracts were the most potent. Those extracts were then submitted to chromatographic separation leading to the isolation of 16 secondary metabolites (four phenanthrenes, three 1,4-phenanthrenquinones, three dibenzyls, two phenolic acid derivatives, two sterols, one dehydrodiconiferyl alcohol derivative, and one simple phenolic compound), including 6-hydroxy-5,7-dimethoxy-1,4-phenanthrenequinone (cymbisamoquinone), which was identified as a new natural product. In parallel, 48 metabolites were identified by UPLC-HRMS analysis of the extracts. The biological evaluation of the isolated compounds revealed that gigantol and tristin present important anti-tyrosinase activity, while bulbophyllanthrin, 3-hydroxy-2,4,7-trimethoxy-phenanthrene, marylaurencinol A, 5-hydroxy-2-methoxy-1,4-phenanthrenequinone, and ephemeranthroquinone B show dose-dependent anti-collagenase activity. In contrast to isolated metabolites, which may act selectively on specific enzymes, the initial total extracts exhibited inhibitory activity against tyrosinase, elastase, and collagenase enzymes, thus showing better prospects for use in dermo-cosmetic formulations

Phytochemical Analysis and Dermo-Cosmetic Evaluation of <i>Cymbidium</i> sp. (Orchidaceae) Cultivation By-Products

Cymbidium is one of the most popular genera in Orchidaceae family, commercialized either as loose flowers or as potted plants in floriculture worldwide. The non-marketable parts are typically discarded (e.g., unsuitable flowers, leaves, pseudobulbs, roots), generating an enormous quantity of unutilized biomass. The above by-products were studied through phytochemical analysis and investigated for their dermo-cosmetic potential. The initial antioxidant, anti-tyrosinase, anti-elastase, and anti-collagenase assays of the total extracts indicated that the pseudobulb and root ethyl acetate extracts were the most potent. Those extracts were then submitted to chromatographic separation leading to the isolation of 16 secondary metabolites (four phenanthrenes, three 1,4-phenanthrenquinones, three dibenzyls, two phenolic acid derivatives, two sterols, one dehydrodiconiferyl alcohol derivative, and one simple phenolic compound), including 6-hydroxy-5,7-dimethoxy-1,4-phenanthrenequinone (cymbisamoquinone), which was identified as a new natural product. In parallel, 48 metabolites were identified by UPLC-HRMS analysis of the extracts. The biological evaluation of the isolated compounds revealed that gigantol and tristin present important anti-tyrosinase activity, while bulbophyllanthrin, 3-hydroxy-2,4,7-trimethoxy-phenanthrene, marylaurencinol A, 5-hydroxy-2-methoxy-1,4-phenanthrenequinone, and ephemeranthroquinone B show dose-dependent anti-collagenase activity. In contrast to isolated metabolites, which may act selectively on specific enzymes, the initial total extracts exhibited inhibitory activity against tyrosinase, elastase, and collagenase enzymes, thus showing better prospects for use in dermo-cosmetic formulations

Discovering the Next-Generation Plant Protection Products: A Proof-of-Concept via the Isolation and Bioactivity Assessment of the Olive Tree Endophyte <i>Bacillus</i> sp. PTA13 Lipopeptides

Endophytic microorganisms (EMs) have recently attracted interest for applications in plant protection, mainly due to their bioactive compound-producing capacity. Therefore, we underwent the task of isolating olive tree EMs and investigating their bioactivity against the devastating pathogen Colletotrichum acutatum. Several EMs were isolated; however, the Bacillus sp. PTA13 isolate exhibited the highest toxicity to the phytopathogen. Bacteria of the genus Bacillus exhibit superior bioactive metabolite-producing capacity, with the lipopeptides (LPs) of surfactin, iturin, and fengycin groups being the most studied. A total LP extract and several fractions were obtained, and their bioactivity was assessed against C. acutatum strains. LPs of the major surfactin, iturin, and fengycin groups and the minor gageotetrin and bacilotetrin groups were annotated. The results confirmed the bioactivity of the major LPs, with fengycins being the most fungitoxic. Interestingly, the minor LP fraction exhibited selective toxicity to the fungicide-resistant C. acutatum isolate, an observation that highlights the significance of our approach to comprehensively mine the total LP extract. This work represents a proof of concept of the exploitation of EMs in customized olive tree plant protection and aligns well with strategies that focus on the sustainability and safety of food production via the development of next-generation plant protection products

Discovering the Next-Generation Plant Protection Products: A Proof-of-Concept via the Isolation and Bioactivity Assessment of the Olive Tree Endophyte Bacillus sp. PTA13 Lipopeptides

Endophytic microorganisms (EMs) have recently attracted interest for applications in plant protection, mainly due to their bioactive compound-producing capacity. Therefore, we underwent the task of isolating olive tree EMs and investigating their bioactivity against the devastating pathogen Colletotrichum acutatum. Several EMs were isolated; however, the Bacillus sp. PTA13 isolate exhibited the highest toxicity to the phytopathogen. Bacteria of the genus Bacillus exhibit superior bioactive metabolite-producing capacity, with the lipopeptides (LPs) of surfactin, iturin, and fengycin groups being the most studied. A total LP extract and several fractions were obtained, and their bioactivity was assessed against C. acutatum strains. LPs of the major surfactin, iturin, and fengycin groups and the minor gageotetrin and bacilotetrin groups were annotated. The results confirmed the bioactivity of the major LPs, with fengycins being the most fungitoxic. Interestingly, the minor LP fraction exhibited selective toxicity to the fungicide-resistant C. acutatum isolate, an observation that highlights the significance of our approach to comprehensively mine the total LP extract. This work represents a proof of concept of the exploitation of EMs in customized olive tree plant protection and aligns well with strategies that focus on the sustainability and safety of food production via the development of next-generation plant protection products