2 research outputs found
Die funktionelle Bedeutung geladener AminosÀurereste im humanen Organische-Anionen-Transporter 1
Der organische-Anionen-Transporter 1 (OAT1) ist fĂŒr
die renale Ausscheidung organischer Anionen von groĂer
Bedeutung. Dennoch ist gegenwĂ€rtig wenig ĂŒber
Struktur-Wirkungsbeziehungen und ĂŒber die Bindung und
Translokation von Substraten bekannt. In dieser Arbeit
wurden konservierte, positive geladene AminosÀurereste
des OAT1 untersucht, die etwas mit Substratbindung und
transport zu tun haben könnten. AuĂerdem wurden der
Einfluss des pH-Wertes und des Chlorids auf die
TransportaktivitÀt des OAT1 sowie seine Wechselwirkung
mit Zitratzyklusderivaten untersucht. Die
Carboxyfluorescein-Aufnahme in HEK293-Zellen, die den
humanen OAT1 stabil exprimierten, wurde durch
alpha-Ketoglutarat > Succinat > Zitrat > Malat
im Medium gehemmt. Die Entfernung von Chlorid aus dem
Medium hemmte die AktivitÀt des OAT1 deutlich, wÀhrend
eine AnsÀuerung von pH 7,4 auf 6,0 den Transport von
radioaktiv markiertem p-Aminohippurat (PAH) und
Glutarat signifikant stimulierte. Durch gerichtete
Mutagenese wurden diverse geladene AminosÀurereste
ersetzt und die Mutanten funktionell charakterisiert.
Der Ersatz des Arginins an Position 446 in der 11.
TransmembrandomÀne durch das ebenfalls positiv geladene
Lysin (R466K) fĂŒhrte zu einer starken Reduktion der
PAH-Aufnahme bei unverÀnderter Proteinexpression in der
Membran von Xenopus laevis Oozyten. Die PAH-Aufnahme
wurde durch extrazellulÀres Glutarat gehemmt und durch
intrazellulÀres Glutarat stimuliert, was auf eine
unverÀnderte Interaktion der R466K-Mutante mit
Dikarboxylaten hindeutet. Wenn aber das Arginin durch
das negativ geladene Aspartat (R466D) ausgetauscht
wurde, war die Wechselwirkung mit Glutarat aufgehoben.
Im Gegensatz zum Wildtyp-OAT1 wurde die PAH-Aufnahme
durch die R466K-Mutante nicht mehr durch Chlorid
stimuliert. Auch der Transport von markiertem Glutarat
und Ochratoxin war beim Wildtyp, nicht aber bei der
R466K-Mutante chloridabhÀngig. Untersuchungen zur
Transportkinetik ergaben, dass Chlorid beim Wildtyp-OA
T1 die Vmax erhöht, die AffinitÀt (Km) aber
unbeeinflusst lÀsst. Die R466K-Mutante zeigte eine
reduzierte Vmax bei gegenĂŒber dem Wildtyp unverĂ€nderter
Km fĂŒr PAH. Wir schlieĂen aus den Befunden, dass das
Arginin 466 mit Chlorid interagiert und fĂŒr den
PAH-Translokationsschritt von Bedeutung ist