On the interpretation of decay-associated fluorescence spectra in proteins

Calculating decay-associated spectra (DAS) is a common mode of analyzing complex fluorescence decay in proteins. Unfortunately, these spectra are attributed almost exclusively to certain species in the population of macromolecules (retainers), often without sufficient evidence. An alternative explanation of decay heterogeneity, based on structural relaxation., was believed to require a negative DAS component. Here we demonstrate that dipolar relaxation of the indole molecule, lacking any rotameric forms, doesn't always result in negative pre-exponential amplitude. We conclude that the shape of DAS alone is not sufficient to differentiate among various causes of heterogeneity of tryptophan fluorescence decay in proteins.Расчет спектров, ассоциированных с затуханием (САЗ), явля­ется обычным путем анализа сложного затухания флюорес­ценции в белках. К сожалению, эти спектры почти исключи­тельно относят к определенным видам в популяции молекул (ротамеров), часто без достаточных оснований Считалось, что альтернативное объяснение гетерогенности затухания, связанное со структурной релаксацией, требует отрицатель­ной компоненты САЗ. В данной работе мы демонстрируем, что дипольная релаксация молекулы индола, лишенной каких-либо ротамерных форм, не всегда приводит к отрицательным при-экспоненциальным амплитудам. Мы делаем вывод о том, что форма САЗ сама по себе недостаточна, чтобы опреде­лить среди других причину гетерогенности затухания триптофановой флюоресценции в белках.Обрахунок спектрів, асоційованих із затуханням (САЗ), є звичайним шляхом аналізу складного затухання флюоресценції в білках. На жаль, ці спектри майже виключно відносять до певних видів у популяції молекул (ротамерів), часто без достатніх на те підстав. Вважалося, що альтернативне пояснення гетерогенності затухання, пов'язане зі структур­ною релаксацією, потребує негативної компоненти САЗ. У цій роботі ми демонструємо, що дипольна релаксація молекули індолу, позбавленої будь-яких ротамерних форм, не завжди призводить до негативних при-експоненціальних амплітуд. Ми робимо висновок стосовно того, що форма САЗ сама по собі не є достатньою, щоб вирізнити серед інших причину гетерогенності затухання триптофанової флюоресценції в білках

Insertion intermediate of annexin B12 is prone to aggregation on membrane interfaces

Annexin B12 (ANX) is known to insert across the lipid bilayer at acidic pH in the absence of Ca²⁺ and to form a pore-like structure consisting of several transmembrane helices, most of which are unknown. Our previous studies demonstrate that the insertion proceeds via an interfacial refolded intermediate state, which can be stabilized by anionic lipids. Energy transfer measurements in a mixture of donor- and acceptor-labeled ANX indicate that this interfacial intermediate, unlike the final transmembrane conformation, is prone to aggregation. Such aggregation of a non-inserted ANX may have implications for a possible general mechanism of misfolding of membrane proteins.Відомо, що анексин В12 (ANX) вбудовується в ліпідний бішар при кислих рН у відсутності Са²⁺ та утворює пороподібну структуру, яка складається з кількох трансмембранних спіралей, більшість з яких невідома. Наші попередні дослідження показали, що вбудовування відбувається за участі поверхневого фолдингового інтермедіату, що може бути стабілізованим аніонними ліпідами. Виміри переносу енергії в суміші ANX, міченого донором та акцептором, вказують на те, що цей поверхневий інтермедіат, але не кінцева трансмембранна конформація, є схильний до агрегації. Ця агрегація невбудованого ANX може мати наслідки для можливого загального механізму місфолдингу мембранних білківИзвестно, что аннексин В12 (ANX) встраивается в липидный бислой при кислых рН в отсутствие Са²⁺ и образует пороподобную структуру, состоящую из нескольких трансмембранных спиралей, большинство из которых неизвестно. Наши предшествующие исследования показали, что встраивание происходит посредством поверхностного фолдингового интермедиата, стабилизируемого анионными липидами. Измерения переноса энергии в смеси ANX, меченного донором и акцептором, указывают на то, что этот поверхностный интермедиат, но не конечная трансмембранная конформация, подвержден агрегации. Такая агрегация невстроенного ANX может иметь последствия для возможного общего механизма мисфолдинга мембранных белков

Fluorescence tools for studies of membrane protein insertion

The transition of soluble proteins into lipid membranes and their refolding therein is fundamental to numerous physiological and disease processes. In this review, we present the summary of the application of fluorescence spectroscopy for studying posttranslational insertion of membrane proteins into lipid bilayers. Various methods utilizing environment-sensitive probes, FRET, FCS and fluorescent quenching for structural and kinetic characterization of protein-lipid interactions are discussed. We also describe the application of steady-state and time-resolved fluorescence quenching by lipid-attached quenchers to characterize the membrane protein immersion into the lipid bilayer. Finally, we illustrate the use of the entire battery of spectroscopic approaches to characterize structural, kinetic and thermodynamic properties of the pH-triggered insertion/refolding pathway of the diphtheria toxin translocation domain.Перехід розчинних білків до ліпідної мембрани та їх подальша перебудова є фундаментальною ланкою у чисельних фізіологічних та біохімічних процесах. У цьому огляді нами наведено підсумки використання флуоресцентної спектроскопії у дослідженні посттрансляційного вбудовування мембранних білків до ліпідних бішарів. Розглянуто різноманітні методи, які використовують спектральні зонди, чутливі до зовнішнього оточення, ферстерівське резонансне перенесення енергії (ФРПЕ), флуоресцентну кореляційну спектроскопію (ФКС) та гасіння флуоресценції у встановленні структурних та кінетичних характеристик білок-ліпідної взаємодії. Наведено приклади застосування стаціонарного та часо-розділенного гасіння флуоресценції ліпідно-зв’язаними гасниками для дослідження занурення мембранних білків до ліпідного бішару. Наприкінці нами показано комбіноване використання різноманітних спектральних підходів для цілісного вивчення структурних, кінетичних та термодинамічних властивостей рН-індукованої послідовності процесів вбудовування\перебудови транслокаційного домену дифтерійного токсину.Переход растворимых белков в липидную мембрану и их дальнейший рефолдинг является фундаментальной частью во многочисленных физиологических и биохимических процессах. У этом обзоре нами приведено обобщение применения флуоресцентной спектроскопии в изучении посттрансляционного встраивания мембранных белков в липидные бислои. Рассмотрены разнообразные методы, которые используют спектральные зонды, чувствительные к внешнему окружению, ферстеровский резонансный перенос энергии (ФРПЭ), флуоресцентную корреляционную спектроскопию (ФКС) и тушение флуоресценции для установления структурных и кинетических характеристик белок-липидного взаимодействия. Приведены примеры применения стационарного и время-разрешенного тушения флуоресценции липидно-связанными тушителями для изучения погружения мембранных белков в липидный бислой. Подводя итог нами показано комбинированное применение разнообразных спектральных подходов для целостного изучения структурных, кинетических и термодинамических свойств рН-индуцированной последовательности процессов встраивания\рефолдинга транслокационного домена дифтерийного токсина

Insertion intermediate of annexin B12 is prone to aggregation on membrane interfaces

Annexin B12 (ANX) is known to insert across the lipid bilayer at acidic pH in the absence of Ca²⁺ and to form a pore-like structure consisting of several transmembrane helices, most of which are unknown. Our previous studies demonstrate that the insertion proceeds via an interfacial refolded intermediate state, which can be stabilized by anionic lipids. Energy transfer measurements in a mixture of donor- and acceptor-labeled ANX indicate that this interfacial intermediate, unlike the final transmembrane conformation, is prone to aggregation. Such aggregation of a non-inserted ANX may have implications for a possible general mechanism of misfolding of membrane proteins.Відомо, що анексин В12 (ANX) вбудовується в ліпідний бішар при кислих рН у відсутності Са²⁺ та утворює пороподібну структуру, яка складається з кількох трансмембранних спіралей, більшість з яких невідома. Наші попередні дослідження показали, що вбудовування відбувається за участі поверхневого фолдингового інтермедіату, що може бути стабілізованим аніонними ліпідами. Виміри переносу енергії в суміші ANX, міченого донором та акцептором, вказують на те, що цей поверхневий інтермедіат, але не кінцева трансмембранна конформація, є схильний до агрегації. Ця агрегація невбудованого ANX може мати наслідки для можливого загального механізму місфолдингу мембранних білківИзвестно, что аннексин В12 (ANX) встраивается в липидный бислой при кислых рН в отсутствие Са²⁺ и образует пороподобную структуру, состоящую из нескольких трансмембранных спиралей, большинство из которых неизвестно. Наши предшествующие исследования показали, что встраивание происходит посредством поверхностного фолдингового интермедиата, стабилизируемого анионными липидами. Измерения переноса энергии в смеси ANX, меченного донором и акцептором, указывают на то, что этот поверхностный интермедиат, но не конечная трансмембранная конформация, подвержден агрегации. Такая агрегация невстроенного ANX может иметь последствия для возможного общего механизма мисфолдинга мембранных белков