Стабильность 5'-диметокситритильной защитной группы синтетического олигонуклеотида в условиях полимеразной цепной реакции

Modification of 5'-OH group of nucleic acids by substituents with various physicochemical properties is important for molecular biology. Investigation of symmetric and asymmetric substitution of 5'-hydroxyl of dsDNA by 4,4'-dimetho-xytrityl (DMT) group seems interesting. Symmetric substitution can allow performing a selective ligation of dsDNA assembled from oligonucleotides by polymerase chain reaction as compared to shortened assembly by-products into a plasmid vector. Synthesis of asymmetrically labeled 5'-DMT dsDNA in case of presence of exonuclease specific to 5'-end modifications will allow obtaining a long synthetic ssDNA used for site-specific gene insertion into a genome by CRISPR/Cas9 technique. To conduct such investigations, it is necessary to know whether synthetic 5'-DMT oligonucleotide is stable under PCR conditions. Here we demonstrated by high performance liquid chromatography with UV (260 nm) and mass-spectrometric detection that 5'-DMT group of synthetic oligonucleotide is stable under PCR conditions but the presence of thiol compounds can decrease a yield of 5'-DMT dsDNA. We plan a further research on influence of 5'-DMT group of synthetic DNA on functionality of various enzymes.Модификация 5-OH группы нуклеиновых кислот заместителями с различными физико-химическими свойствами имеет принципиальное значение для молекулярной биологии. Интересным представляется исследование симметричного и асимметричного замещения 5'-гидроксила двуцепочечной ДНК (дцДНК) 4,4'-диметок-ситритильной (ДМТ) группой. Симметричное замещение может позволить осуществлять селективное лигирование дцДНК в плазмидный вектор после ее сборки из олигонуклеотидов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) по сравнению с побочными укороченными продуктами сборки. Синтез асимметрично меченной 5'-ДМТ дцДНК при условии наличия специфичной к модификациям 5'-конца экзонуклеазы позволит получать протяженную синтетическую оцДНК, применяемую для сайт-специфичного включения гена в геном с использованием технологии CRISPR/ Cas9. Чтобы провести подобные исследования необходимо выяснить, стабилен ли синтетический 5'-ДМТ олигонуклеотид в условиях ПЦР. B данной работе методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ (260 нм) и масс-спектрометрической детекцией мы показали, что 5'-ДМТ-группа стабильна в составе синтетического олигонуклеотида в условиях ПЦР, однако присутствие тиольных соединений может снижать выход 5'-ДМТ-дцДНК. Мы планируем дальнейшее изучение влияния 5'-ДМТ-группы в составе синтетических ДНК на функционирование различных ферментов

In silico анализ влияния фосфорилирования на структуру стероид-гидроксилаз человека CYP17A1 И CYP19A1

The trajectories of molecular dynamics simulation of phosphorylated S258 (CYP17A1), T162 and Y361 (CYP19A1) were analyzed to understand a possible mechanism of influence of post-translational modification (PTM) on the structure and functions of human sterol-hydroxylases CYP17A1 and CYP19A1. It was found that PTM has no dramatic influence on the structures of the enzymes but stabilizes them. According to our data, the phosphorylation of S258, T162 and Y361 influences the interface of interaction between human sterol-hydroxylases and the corresponding electron donors by decreasing the mobility of amino acids that take part in forming molecular complexes of the enzymes and the corresponding redox-partners. The phosphorylation of T162 (CYP19A1) decreases the mobility of amino acids forming access channel. The obtained results can shed light on the mechanism of fast regulation of human CYP17A1 and CYP19A1 activity by PTM.С целью изучения влияния пост-трансляционных модификаций (ПТМ) на структуру и функции стероид-гидроксилаз человека CYP17A1 и CYP19A1 проведен анализ траекторий молекулярной динамики ферментов, содержащих модифицированные фосфогруппами аминокислотные остатки S258 (CYP17A1), T162 и Y361 (CYP19A1). Показано, что наличие ПТМ в структуре белка не приводит к значительным изменениям пространственной структуры ферментов и увеличивает общую стабильность белковой глобулы. Установлено, что фосфорилирование S258, T162 и Y361 оказывает влияние на интерфейс взаимодействия стероид-гидроксилаз с соответствующими донорами электронов путем уменьшения подвижности аминокислотных остатков, участвующих в формировании молекулярных комплексов с редокс-партнерами. Обнаружено, что фосфорилирование T162 (CYP19A1) приводит к уменьшению подвижности аминокислотных остатков, формирующих канал доступа субстрата в активный центр фермента. Полученные результаты проясняют механизм быстрой регуляции активности CYP17A1 и CYP19A1 человека посредством ПТМ

Экспрессия и очистка рекомбинантного термостабильного ДНК-связывающего белка Sso7d

The Sso7d protein has exceptional structural stability and the ability to bind highly specifically to DNA, which makes the protein a promising module for creating fusion proteins and test systems. Sso7d is a part of fusion high-fidelity DNA polymerases capable of carrying out the polymerase chain reaction even in the presence of PCR inhibitors. Application of faster, simpler, and more efficient method for protein production will significantly reduce the cost of creating biosensors and conducting analyzes. This paper describes a new efficient method for obtaining recombinant Sso7d protein with a high degree of purity without using affinity chromatography.Белок Sso7d обладает исключительной стабильностью структуры, а также способностью высокоспецифично связываться с ДНК, что делает белок перспективным модулем для создания химерных белков и тест-систем. Sso7d является компонентом химерных высокоточных ДНК-полимераз, способных осуществлять полимеразную цепную реакцию даже в присутствии ингибиторов ПЦР. Применение более быстрого, простого и высокопроизводительного метода получения белка позволит существенно сократить расходы на создание биосенсоров и на проведение анализов. Описан новый эффективный способ получения рекомбинантного белка Sso7d с высокой степенью чистоты без использования аффинной хроматографии

Дизайн структуры химерного белка ДНК-экзотрансферазы быка и SSB-белка E. coli

The analysis of the trajectories of molecular dynamics simulation and spatial structures of homologous models of fusion protein with various linkers was performed to understand the effect of the additional DNA-binding domain of the E. coli SSB protein attached to the truncated and native bovine DNA exotransferase on its stability and activity. It is found that the C-terminus of the enzyme is the preferred end for attachment of the E. coli protein, while the stability of the truncated fusion enzyme is higher than the native one. According to molecular dynamics data, introducing linkers between two proteins for the native (GGGGSGGGSGGGGS, GGGSGGGS, and TCT) and truncated (GGSGGGSGG, GGGGGG, GTGSGT, and 5xGGGGS) forms of the enzyme not only improves its stability, but also increases the mutual mobility of DNA-affinity domains.С целью изучения влияния дополнительного ДНК-связывающего домена SSB-белка E. coli, присоединенного к транкированной и нативной ДНК-экзотрансферазе быка, на ДНК-аффинность и стабильность фермента, проведен анализ траекторий молекулярной динамики и пространственных структур гомологичных моделей химерного белка с различными линкерами. Установлено, что более предпочтительным для присоединения SSB-белка является C-концевая последовательность фермента, при этом прогнозируемая стабильность транкированного химерного фермента выше, чем у нативного. Согласно данным молекулярной динамики, введение линкеров между двумя белками для нативной (GGGGSGGGSGGGGS, GGGSGGGS и TCT) и транкированной (GGSGGGSGG, GGGGGG, GTGSGT и 5xGGGGS) формы фермента не только способствует повышению его стабильности, но и увеличивает взаимную подвижность ДНК-аффинных доменов.The analysis of the trajectories of molecular dynamics simulation and spatial structures of homologous models of fusion protein with various linkers was performed to understand the effect of the additional DNA-binding domain of the E. coli SSB protein attached to the truncated and native bovine DNA exotransferase on its stability and activity. It is found that the C-terminus of the enzyme is the preferred end for attachment of the E. coli protein, while the stability of the truncated fusion enzyme is higher than the native one. According to molecular dynamics data, introducing linkers between two proteins for the native (GGGGSGGGSGGGGS, GGGSGGGS, and TCT) and truncated (GGSGGGSGG, GGGGGG, GTGSGT, and 5xGGGGS) forms of the enzyme not only improves its stability, but also increases the mutual mobility of DNA-affinity domains

БЕЛКОВОЕ ПРОФИЛИРОВАНИЕ КЛЕТОК HepG2 С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ «SHOTGUN» ПРОТЕОМИКИ КАК МЕТОД, ПРИМЕНИМЫЙ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОПТАТОВ

The results of shotgun proteomic analysis of microgram quantities of hepatocellular carcinoma cells (HepG2) are described. Identified is a number of proteins which have been reported to be biomarkers and therapy targets.Описаны результаты применения «Shotgun» протеомного подхода в анализе микрограммовых количеств биологического материала с целью идентификации специфических белковых маркеров в клеточной линии высокодифференцированной гепатоцеллюлярной карциномы HepG2.

In silico анализ взаимодействия соединений, содержащих фотоактивируемые группы, с ферментами CYP7 человека

In silico analysis of “protein-ligand” complexes of human CYP7 enzymes with modified borondipyrrome-tene (BODIPY) and steroids, containing photo-activated crosslinking groups, wasperformed in order to identify structural peculiarities of their interaction. It was found that BODIPY molecules and DHEA derivative with diazirine group are able to bind tightly with human steroid-hydroxylases. Binding affinity is comparable with corresponding values for essential ligands of the enzymes. Binding mode of the modified steroid corresponds to the binding mode of essential CYP7 ligands, so formation of hydroxylated products is possible. It was found that presence of both diazirine and NBD groups in a molecule significantly increases affinity of the compound in case of CYP7A1 and, especially, CYP7B1. Amino acid residues, located in a close proximity with photo-activated groups were detected, that can form covalent adducts with them. The obtained results can shed light on the mechanism of interaction of the compounds with recombinant human CYP7 enzymes in vitro. The results can also be used for the identification of modified amino acids of the proteins that are formed under photoactivation of the compounds in vitro.С целью выявления структурных особенностей взаимодействия ферментов CYP7 человека с производными бордипирометена (BODIPY) и стероидов, содержащих фотоактивируемые сшивающие группы, проведен in silico анализ комплексов «белок-лиганд». Показано, что модифицированные молекулы BODIPY, а также производное дегидроэпиандростерона с диазириновой группой способны связываться в активном центре стероид-гидроксилаз человека с аффинностью, сравнимой с соответствующими величинами, рассчитанными для природных субстратов этих ферментов. При этом геометрия комплекса «фермент-лиганд» для модифицированного стероида в активном центре также соответствует геометрии комплексов CYP7 со своими природными лигандами, что указывает на возможность образования гидроксилированных продуктов реакции - меченых аналогов биометаболитов. Показано, что наличие одновременно диазириновой и 7-нитробензофуразановой групп значительно снижает сродство лиганда к активному центру CYP7A1 и, в особенности, CYP7B1. Идентифицированы аминокислотные остатки, расположенные вблизи фотоактивируемых групп и способные образовывать с ними ковалентные аддукты. Полученные результаты представляют интерес для объяснения механизма взаимодействия соединений, содержащих фотоактивируемые сшивающие группы с рекомбинантными ферментами CYP7 человека in vitro, а также для идентификации продуктов ковалентной модификации аминокислотных остатков белка, образующихся при фотоактивации исследованных молекул

Влияние способа функционализации поверхности серебра на спектры гигантского комбинационного рассеяния цито­хрома Р450 7В1

Analysis of the surface­enhanced Raman spectra (SERS) of cytochrome P450 7B1 (CYP7B1) shows, that CYP7B1 is ad­ sorbed irreversibly on silver surface, functionalized by TGA, 2­AET. It was concluded that CYP7B1 with DHEA, modified by MUA, is a suitable system to analyze by SERS the structure of protein without denaturation.Анализ спектров гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) цитохрома Р450 7В1 (CYP7B1) показы-вает, что CYP7B1 необратимо адсорбируется на поверхности серебра, функционализированного ТГК, 2-МЭА. Сделан вывод, что CYP7B1 с ДГЭА, модифицированный МУК, является подходящей системой для анализа методом ГКР структуры белков, не приводящей к их денатурации

Preparation of hypericin enriched St. John's wort extracts

Results of solid phase extraction (SPE) of St. John' s Wort extracts were described. In order to obtain the extract the air-dried plant material of Hypericum perforatum L. (cultivar Yantar) grown in the Central Botanical Garden of NAS of Belarus was used. Analysis of the St. John's wort extract solutions was carried out by electronic absorption spectroscopy. It was shown the influence of the nature of the solvent on the spectral characteristics of the ex tract. The sorbent Waters Sep-Pak S18®Vac RC was used for solid-phase extraction. The methanol solutions of different concentrations were used as an eluent system. For SPE metanol fractions absorption and fluorescence spectra were registered. It is shown that the main part of hypericin was eluted with 80% methanol. The values of quantum yields were calculated. These results suggest that solid phase extraction on the non-polar sorbent is a promising way to increase the content of the hypericin in the St. John's Wort extracts

Unusual morphology of equimolar Ar–Kr alloys

The transmission high electron energy diffraction (THEED) technique was employed for studying the structure of the equimolar Ar–Kr alloy, in which the thermodynamics predicts the maximum feasibility of phase separation. Deposition of preliminarily cooled gas mixtures was performed onto substrates cooled to 6 or 20 K. All diffraction patterns contained several sets of reflections against an appreciable background. Analysis of the data obtained during a warm-up from 6 to 33 K (at which the major part of argon was removed due to sublimation) as well as of the diffraction pattern from the “sandwich” (two successively deposited film of pure Ar and Kr) provided reliable arguments for the following conclusions. Actually, we have documented for the first time a phase separation of an Ar–Kr mixture, manifestations of which turned out to be oddly asymmetric as far as the behavior of the components involved is concerned. Upon deposition both onto 6 or 20 K the emerging sample contained two crystal phases of virtually pure argon with a small admixture of krypton. One of the Ar phases (fcc) did not cause a surprise, whereas the other was hcp with the a/c ratio close to the ideal value. The krypton component separated as a fine-grained glass-like state, possibly, with a low admixture of argon