Purification of acetyl CoA carboxylase and change of enzyme activities by trypsin treatment

의학과/석사[한글] Acetyl CoA carboxylase는 생체 내에서 단기적으로는 cirtrate 및 isocitrate에 의해서 활성화되면 장기적으로는 nutritional 또는 hormonal state에 따라서 조절된다고 보고되어 있다. 그러나 생체 외에서는 cirtrate나 isocitrate에 의해서 뿐만 아니라 tryspin처리시 또는 오랜 시간 동안의 냉장고 내 보관시에도 그 활성도가 증가한다는 사실도 보고되어 있으나 그 기전은 아직 잘 밝혀져 있지 않다. 본 연구는 trypsin처리시 또는 오랫동안 냉장고 보관시에 이 효소활성이 증가하는 사실을 구명하기 위하여 장시간 굶긴 백서에 무지방 고함수탄소식이를 재투여하여 이 백서 간장세포로부터 polyethylene glycol, ammonium sulfate, Sepharose 2B gel filtration, DEAE-Sephacel column chromatography를 이용하여 actyl CoA carboxylase를 분리 정제하여 이 효소 활성도와 이때 이 효소를 구성하는 소단위 단백질의 분자량과의 상호관계를 밝히고 부분정제된 acetyl CoA carboxylase에 trypsin을 처리하여 이 효소의 활성도변화를 비교 관찰하였다. 백서을 3일간 굶긴 다음 고함수탄소 식이를 3일간 재투여한 후 간장세포에서 acetyl CoA carboxylase를 polyethylene glycol 및 ammonium sulfate를 처리한 후 Sepharose 2B gel filtration을 시행하여 1,522배 분리 정제 하였으며 이 효소의 specific activity는 단백질 mg당 3.88units이었다. 이때 SDS-PAGE를 시행하여 분자량 220,000 및 120,000에 해당하는 주된 단백질대를 확인하였다. 이 효소용액을 DEAE-Sephacel column chromatography를 시행하였던 바 약 12,000배 분리 정제하였으며 이 효소의 specific activity는 단백질 mg 당 30 units이었다. 이때 SDS-PAGE를 시행하여 분석해 본 결과 Sepharose 2B gel filtration 시행 후 SDS-PAGE 상에서 나타났던 분자량 220,000에 해당하는 단백질대가 소실되면서 분자량 120,000 및 110,000에 해당하는 단백질대가 나타났는데 이는 분리 과정 중 proteolytic enzyme에 의하여 가수분해된 결과로 사료되며 이때 효소 활성도가 7.55배 증가되었다. Sepharose 2B gel filtration 시행 후 얻은 효소를 토끼에 주사하여 얻은 항 혈청과 간장세포 균등액을 20,000xg로 원침하여 얻은 상층액의 3% polyethylene glycol 추출액과 작용시켜 Ouchterlony double immunodiffusion 실험을 한 결과 항 혈청 15μl는 간장세포 균등액과 반응하여 서로 연결된 하내의 침전대가 형성되었으며, 이 항 혈청을 가지고 protein A Sepharose column chromatography를 시행하여 얻은 IgG 농도를 증가시켜 첨가하면 acetyl CoA carboxylase 활성은 IgG 농도에 비례하여 억제된 사실로 미루어 가토 혈청에서 분리한 IgG에는 acetyl CoA carboxylase에 대한 항체가 생성되었음을 재 확인하였다. 부분정제된 acetyl CoA carboxylase 효소 용액에 trypsin을 단백질 mg당 0.625, 1.25, 1.875μg씩 가하여 1분 동안 반응시킨 후의 각 효소 활성도는 각각 375%, 382%, 173%로 증가하였으나 trypsin 농도가 증가함에 따라 효소활성은 0.625μg시에 비하여 75.2%, 46.1%를 나타내었다. 또한 trypsin을 일정량(1.5μg) 가한 뒤 반응시간을 증가시킴에 따라 그 활성도가 1분에서 2분까지는 250%, 194%로 증가하나 5분, 10분 후에는 92%, 34%로 점차 감소하였다. 이런 결과는 trypsin에 의해 이 효소 단백질이 분자량 110,000 또는 120,000 이하로 절단되면 효소활성이 소실되는 사실을 시사하며 이 사실은 SDS-PAGE상에 나타난 결과와 일치한다. [영문] On the contrary to the report that acetyl CoA carboxylase is a single polypetide of MW 220,000-260,000 that contains 2-6 moles of phosphate and 1 mole of biotin, the enzyme has been suggested to have a MWs of 220,000-260,000 composed of 2 subunits with MWs of 220,000 and 108,000. It has been known that acetyl CoA carboxylase activity is stimulated by citrate or isocitrate temporarily and also regulated by nutritional and hormonal state for a long term in vivo. It has been reported that acetyl CoA carboxylase activity was stimulated by trypsin treatment or by the prolonged storage in the refrigerator as well ascitrate or isocitrate in vitro. In the present study, acetyl CoA carboxylase was purified from the liver of rats refed with a fat free high cabohydrate diet after the 3 days fasting, through polyethylene glycol, ammonium sulfate precipitation, Sepharose 2B gel filtration and DEAE-Sphacel column chromatorgraphy, and the MWs of subunits and the change in the enzyme activity were measured. Acetyl CoA carboxylase purified 1,522 folds from the liver of rats fasted for 3 days then by refed with a fat free high carbohydrate diet and had a specific activity of 3.88 Units/mg protein. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of this enzyme showed two protein bands corresponding MWs of 220,000 and 120,000. Specific activity of acetyl CoA carboxylase obtained after the DEAE-Sephacel column chromatography was 30 Units/mg protein and the enzyme was purified 12,000 folds. Upon SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, only two protein bands corresponding MWs of 120,000 and 110,000 were appeared with the disappearance of a protein band having MWs of 220,000, indicating that proteolytic hydrolysis of the enzyme into two subunits during purification. The reason for the dramatic increase of the enzyme activity by proteolysis is not known. Ouchterlony double immunodiffusion between rabbit antiserum against acetyl CoA carboxylase prepared through Sepharose 2B gel filtration step and 3% polyethylene glycol extract of the 20,000xg supernatant of liver homogenate was carried out. 15ml of antiserum cross-reacted with liver homogenate and formed a sharp hexagonal precipitin. Addition of IgG prepared from the antiserum by protein A Sepharose column chromatography to the 5% polyethylene glycol precipitate of liver homogenate inhibited the actyl CoA carboxylase activity in parallal to the IgG concentration indicating the presence of antibody against acetyl CoA carboxylase in the IgG. Treatment of 0.625, 1.25, 1.875 mg of trypsin to 1 mg of partially purified actyl CoA carboxylase resulted in the increase of the enzyme activity in the order of 375, 282, 178%, respectively. The inhibition of acetyl CoA carboxylase by trypsin(1.5μg/mg protein) was dependent on the incubation time indicating that the extensive hydrolysis of the enzyme by trypsin decreased the enzyme activity.restrictio

Application of antisense RNA against the RBC type glucose transporter (GLUT1) in the change of glucose uptake in tumor cells

의학과/박사[한글] 포도당은 포유동물의 중요한 대사연료이며, 세포 원형질막에 존재하는 포도당 운반체(glucose transporters, GLUTs)는 facilitative diffusion 기전에 의해 세포외부에 고농도로 존재하는 포도당을 세포내로 운반하는 막 단백질로서 동일종내에서 각 조직에 따라 분 포하는 형(type)이 양적으로는 미량이지만 중복되기도 하나 그 주요 분포형은 서로 다르다고 알려져 있다. 최근 연구에 따르면 포도당 운반체는 5종류가 보고되어 있으며 이 중 세포성장 상태와 매우 밀접한 관련이 있는 형이 적혈구형 포도당 운반체(GLUTI)로서 암유전자 활성이나 과도한 성장인자(growth factor) 표현에 의해 유도되는 증식상태에 있는 세포에 포도당 공 급을 담당하는 중요한 세포막 단백질이다. 본 연구에서는 GLUTI mRNA에 대한 antisense RNA를 표현하는 GLUTI antisense RNA 구성체를 pMAM vector에 삽입하여 pMAM-GLUTI(rev)을 제조하여 N-ras 암유전자에 의해 암세포로 변형된 NIH 3T3세포내에 transfection 시킨 다음 dexamethasone으로 GLUTI에 대한 antisense RNA의 표현을 유발시키면서 암세포로 변형된 NIH 3T3 세포의 성장 및 특성 변화를 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. pBN-ras로 transfection 시킨 NIH 3T3 세포는 배양시 형태학적으로 전형적인 암세포의 모양을 보이고, soft agar상에서 colony를 형성하였으며, 이 세포의 염색체내에 N-ras의 exon 2부위가 PCR법에 의해 증폭되는 사실로 미루어 보아 이 세포는 N-ras 암유전자에 의해 암세포로 변형되었음을 확인하였다. 2. N-ras에 의해 암세포로 변형된 NIH 3T3 세포의 2-deoxy-D-[1- (3)**H]-glucose 운반능력은 대조군 NlH 3T3 세포에 비하여 반응시작 4분 후에 2.5배, 5분 후 4.5배, 6분 후 6.0배 증가되었으며 암세포내 GLUTI mRNA양은 대조군에 비해 2.5배 증가되었다. 3. GLUTI에 대한 antisense RNA를 전사시킬 수 있는 DNA를 제조하기 위하여 GLUTlcDNA(1.8kb)를 포유동물 세포에서 dexamethasone에 의해 표현이 유도되는 MMTV-LTR을 promoter로 가진 vector인 pMAM의 SalI 절단부위에 역방향으로 subcloning하여 삽입된 방향을 KPnI, Ncol, EcoRl 및 SalI으로 확인하고 pMAM-GLUT1 (rev)이라 명명하였다. 이 vector를 N-ras에 의해 변형된 NIH 3T3 암세포에 transfection 시킨 후 dexamethasone을 처리하여 GLUT1 antisense RNA 크기(2.4kb)에 해당하는 RNA가 표현되는 것을 확인하였다. 4. pMAM-GLUTI(rev)을 transfection 시킨 NIH 3T3 암세포를 두 군으로 나누어 한 군은 dexamethasone으로 GLUTI antisense RNA의 표현을 유도시키고 나머지 군은 유도시키지 않은 대조군으로 하여, 포도당이 운반되는 양은 유도군에서는 1.97±0.13pmo1e glucose/10* *5 cells(2021±106cpm/10**5 cells)로 대조군에 비해 (3.36±0.54pmole glucose/10**5 cells, 3692±591cpm/10**5 cells) 45% 감소되었다. 5. Soft agar상에서 antisense RNA 표현을 유도시킨 군에서는 직경이 50㎛ 이상인 colony 수가 20±3.4개/60 mm**2로 antisense RNA의 표현을 유도시키지 않은 대조군(32±2.8개/60mm**2 )에 비해 40% 감소되었으며, 유도군에서 관찰된 colony의 크기가 대조군에 비 해 전체적으로 작았다. 이러한 결과를 종합해 볼 때 GLUTI antisense RNA가 표현됨으로써 암세포내로 포도당 운반이 감소되고, soft agar assay에서 변형능력이 감소되는 사실로 미루어 보아 세포내에서 GLUTI antisense RNA가 GLUTI mRNA와 결합하여 GLUTI mRNA가 translation하는 과정이 억제되어 암세포가 필요로 하는 포도당을 운반시키는 포도당 운반체의 양이 감소되었기 때문이라고 사료된다. [영문] Sereval studies have shown that transport of glucose in all tissues is mediated by a family of structurally related facilitative glucose carriers that have distinct but overlaping tissue distributions. Recently, five types of glucose transporter were identified in mammalian cells. One of these GLUTs, the GLUTl, which is known as RBC type g1ucose transporter has been known to be closely related to cellular growth states. GLUTI is expressed in most cells and thought to be responsible for "housekeeping" levels of glucose transport. The rate of glucose transport via GLUTl is known to be increased under conditions such as transformation process or serum stimulation of cells. This unique characteristics of GLUTl expression may Provide one of the possible ways to reduce the growth of the cell undergoing cellular transformation. In this study, NIH 3T3 cell was transformed by ras oncogene and the presence of ras in the host chromosome was confirmed by polymerase chain reaction using primers that will amplify the exon 2 region of ras. This cell line showed increased glucose transport, GLUTI mRNA content and the ability to form colonies in soft agar. An expression vector that will express the antisense RNA against the GLUTl mRNA was constructed and named pMAM-GLUTI (rev). To investigate the possibility of application of antisense RNA against the RBC type GLUT1 for suppression of tumor cell growth, pMAM-GLUTI (rev) was transfected into NIH 3T3 cells transformed by ras. The expression of antisense RNA was induced by dexamethasone and confirmed by Northern blot analysis. The GLUTl antisense RNA reduced the amount of glucose transported into cells by 45% compared to control group. The number of colonies sizing over 50㎛ grown in the soft agar in antisense expression group was reduced to 20±3.4 compared to control group(32 ±2.8/60 mm**2 ). From these results, the expression of GLUTl antisense RNA reduce the glucose transport and transforming potential in soft agar by blocking expression of GLUTl mRNA with in the ras transformed NIH 3T3 cell line.restrictio