Regulation of Hsf1 and Msn2 activity by CK2 kinase in Saccharomyces cerevisiae

학위논문 (박사)-- 서울대학교 대학원 : 바이오엔지니어링전공, 2017. 2. 한지숙.Saccharomyces cerevisiae is one of the best-studied useful eukaryotic model organisms for basic biological research. In addition, S. cerevisiae is also very attractive microorganism as an industrial cell factory due to several advantages such as assured safety, well-established genetic and metabolic engineering methods, excellent fermentation ability, and rapid growth under anaerobic condition. Especially, it has great tolerance to a wide range of harsh environmental challenges not only a high concentration of substrate and product but also facing the fermentation processes and cell culture. In response to unfavorable environmental changes, cells rapidly adjust global gene expression programs with inducing many stress-related genes such as heat shock proteins (HSPs) for maintaining cellular homeostasis and cell survival. Stress-induced transcriptional activation of HSP genes is mainly regulated by two stress transcription factors, Hsf1 and Msn2/4. In this dissertation, regulation mechanisms of Hsf1 and Msn2 by CK2 in response to ethanol and several environmental stress were elucidated and applied to stress-tolerant yeast strain. Firstly, we found that CK2-dependent phosphorylation on S608 is an ethanol stress-specific repression mechanism of Hsf1, which does not affect the basal or heat-induced activity of Hsf1. This repression is relieved by dephosphorylation by Ppt1 which directly interacts with Hsf1 via its tetratricopeptide repeat (TPR) domain. In response to ethanol stress, PPT1 deletion and CK2 overexpression exert synergistic inhibitory effects on Hsf1 activation, whereas Hsf1S608A mutant shows enhanced activation. Therefore, regulation of the Hsf1 S608 phosphorylation status by reciprocal actions of CK2 and Ppt1 might play an important role to determine Hsf1 sensitivity towards ethanol stress. Secondly, the reciprocal regulation mechanism of Hsf1 by CK2 and Ppt1 was applied to improve alcohols tolerance for industrial yeast strain. Improving yeast tolerance to alcohols is an important stage toward enabling high titer production. To enhance the ethanol stress-specific activation of Hsf1, CK2-dependent phosphorylation site S608 in Hsf1 was substituted with alanine. The Hsf1S608A strain was showed the improved tolerance to alcohols not just ethanol but also a variety of alcohols, such as methanol, 2,3-butandiol, 2-phenylethanol, 3-methyl-1-butanol, isobutanol, and hexanol. Therefore, CK2-dependent repression mechanism of Hsf1 is applicable for improving yeast tolerance to various alcohols. Thirdly, we demonstrate that CK2-dependent phosphorylation positively regulates Msn2/4, the general stress response transcriptional activators in Saccharomyces cerevisiae, in response to various types of environmental stress conditions. CK2 overexpression elicits hyperactivation of Msn2/4, whereas deletion of one of the CK2 catalytic subunits, especially CKA2, leads to reduced transcriptional activity of Msn2/4 in response to glucose starvation, H2O2, and lactic acid. The CKA2 deletion mutant also shows increased stress sensitivity. CK2 phosphorylates Ser194 and Ser638 in Msn2 and replacement of these residues with alanine leads to reduced Msn2 activity upon stress and reduced tolerance to H2O2 and lactic acid. CKA2 deletion mutant shows shorter nuclear retention time of Msn2 upon lactic acid stress, suggesting that CK2 might regulate nuclear localization of Msn2. However, Msn2S194A, S638A mutant shows normal nuclear import and export patterns upon stress, suggesting that CK2 might positively regulate the general stress response not only by direct phosphorylation of Msn2/4, but also by regulating cellular translocation machinery.Chapter 1. Research background and objective 1 Chapter 2. Literature review 4 2.1. Stress response in Saccharomyces cerevisiae 5 2.2. Stress-responsive transcription factors 6 2.2.1. Msn2 and Msn4 6 2.2.2. Regulation of Msn2 and Msn4 transcriptional activity 8 2.2.3. Hsf1 9 2.2.4. Regulation of Hsf1 transcriptional activity 11 Chapter 3. Materials and methods 15 3.1. Strains and media 16 3.2. Plasmids 20 3.3. RNA preparation and analysis 25 3.4. Proteins preparation 27 3.5. Western blot analysis 28 3.6. In vitro kinase and phosphatase assays 29 3.7. GST pull-down assay 30 3.8. pNPP assay 30 3.9. Fluorescence microscopy 31 Chapter 4. CK2-dependent inhibitory phosphorylation is relieved by Ppt1 phosphatase for the ethanol stress-specific activation of Hsf1 in Saccharomyces cerevisiae 32 4.1. Introduction 33 4.2. Ppt1-dependent dephosphorylation and activation of Hsf1 during growth 35 4.3. Ppt1 physically interacts with Hsf1 in vitro 41 4.4. CK2 phosphorylates S608 in the C-terminal activation domain of Hsf1 49 4.5. Hsf1 is reciprocally regulated by CK2 and Ppt1 upon ethanol stress 62 4.6. Hsf1S608A mutant showed enhanced activation by ethanol, but not by heat shock 67 4.7. Conclusions 71 Chapter 5. CK2-dependent phosphorylation positively regulates stress-induced activation of Msn2 in Saccharomyces cerevisiae 74 5.1. Introduction 75 5.2. Both Msn2 and Msn4 are phosphorylated by CK2 in vitro 78 5.3. Msn2 activity is regulated by CK2 catalytic subunits 81 5.4. CK2 phosphorylates S194 and S638 in Msn2 90 5.5. CK2-dependent phosphorylation of S638 is required for Msn2 activation 90 5.6. CK2 regulates nuclear accumulation of Msn2 96 5.7. Conclusions 100 Chapter 6. Overall discussion and recommendations 101 Bibliography 110 Abstract in Korean 119Docto

Verification of the Effect of Flipped Learning in Meta Analysis

The purpose of this study is to present the direction of future research by examining the learning effect of flipped learning and exploring the effects of various moderator variables. The effectiveness of flipped learning was analyzed in meta analysis. The meta analysis examined the effectiveness of flipped learning and verified the effectiveness of flipped learning by integrating individual studies. I selected a total of 126 publications including journal articles, theses, and dissertation which employed a pretest-posttest design and standardized measurement tools from 2007 to 2017 in Korea and abroad. A total of 433 effect size values were calculated by using the CMA(Comprehensive Meta Analysis) program. Meta analysis can suggest not only the conclusions about the direction between variables but also the direction in which research needs to be done in the field and what direction should be studied in the future(Borenstein, Hedges, Higgins, & Rothestein, 2009). Therefore, I reviewed the flow of flip learning research based on the previous research, investigated whether there is a difference in the effect of flipped learning according to the moderator variable using meta analysis, and search for future research direction. Below are the research questions of this study: 1. What is the overall effect size of flipped learning on learning effectiveness? 2. What is the mean effect size and the mean effect size of each sub-element on the effects of learning by flipped learning (cognitive domain, positive domain, interpersonal domain)? 3. Are there any differences in the mean effect sizes of the flipped learning according to the moderator variables? 3-1. What is the mean effect size according to the general characteristics of flipped learning? 3-2. What is the mean effect of flipped learning design characteristics (before, during, and after class) of flipped learning? Below are the results of this study: First, the total program effect size value based on the random effect model was medium level(effect size= .41). The effect size of flipped learning is significant, and bigger than instructor-led courses. These results suggest that flipped learning has achieved plenty of educational outcomes. Second, the effect size of flipped learning education showed statistically significant effect on cognitive, affective, and interpersonal relations domain. It showes that all domains were medium level such as cognitive(.65), affective(.51), and interpersonal relations domain(.68). Specifically, the cognitive domain, the effects are critical thinking(.71), academic performance(.62), problem solving ability(.49), and self-directed learning ability(.45) from the highest to lowest. The affective domain, the effects were class participation(.80), learning motivation(.69), learning attitude(.59), learning satisfaction(.55), self efficacy(.44) from the highest to lowest. And Interpersonal relationship domains showed communication skills (.74), interaction (.59), and cooperation (.56) from the highest to lowest. In addition, all variables showed median effect. Thus, we need to actively use flipped learning when increase learning effects of cognitive, affective and interpersonal relations domain. Third, as a result of the moderator effect analysis on the general characteristic variable, the statistically significant variables are school type and core subject. In case of flipped learning design characteristic variables are video maker, video time, homework, check up on pre study, number of team member, and time of discussion. Especially, flipped learning is most effective for students in high schools. In addition, the effect size of flipped learning is increased when gave lessons at high school, took the music and korean language classes, used single subject research design, made 10-15mins video times, checked up on pre study, assigned homework, was composed of 4 team member, gave 20mins for discussion time. In addition, we made design implication to gave guideline for instructional designer based on meta analysis results. Specifically, when it is done in high school, when elementary school is used for English, music, and computer curriculum, when middle school for mathematics and home economics, when high school for English and computer curriculum, when university for science and sociology, when the experimental treatment period is 7 weeks, when the video is not produced by teacher, when the video is given for 10 minutes to 15 minutes, when homework is given, When the group member is four, discussion time is most effective when given 20 minutes. Other moderator variables are not statistically significant such as research design, implementation frequency, publication type, publishing area, class type, disability, number of participants, presenting alternatives without prior learning, orientation, presence of self-directed learning activities in advance learning, Whether they are presenting their learning according to the learner level, and presence of supplement and enrichment after class. In this study, design implications are provided based on these results. Design implications are classified into pre learning activity design, face to face class composition, and video production. Based on these results, it can be concluded that flipped learning has a positive effect on learning. However, there is a lack of flipped learning meta-analysis, which makes it difficult to present in-depth discussions. In addition, due to the characteristics of traditional meta analysis methods, there are limitations in calculating the effect size by simultaneously taking into account variables that can affect learning effects. This study also has some limitations in that the proportion of dissertations and domestic research is high.;플립러닝이 성공적으로 교육현장에 적용되고 지속적으로 운영되기 위해서는 수업에 영향을 주는 다양한 변인과 요소들을 탐색하여야 한다. 지금까지는 플립러닝 수업에 긍정적인/부정적인 영향을 주는 설계 요소가 무엇인지에 대한 연구를 찾기에는 어려움이 있었다. 과연 선행연구의 어떠한 점을 적용해야 하고 어떠한 점을 배제해야 하는지 이러한 설계 요소들에 대한 구체적인 분석이 필요하다(송주연, 홍광표, 2016). 본 연구의 목적은 현재까지 진행된 국내·외 플립러닝에 관한 연구들을 통합하는 메타분석을 실시한 후 플립러닝의 설계 및 실행 가이드라인을 제시하는 데 있다. 이를 통해 플립러닝의 효과적인 도입 및 성공적인 적용을 위한 조건과 앞으로 나아갈 방향을 제시하였다. 플립러닝 학습효과에 대한 메타분석이 필요한 이유는 다음과 같다(황성동, 2015). 첫째, 플립러닝 효과에 대한 상반된 결론이 야기되고 있기에 이에 대한 타당한 결론을 내릴 필요가 있다. 동일한 대상과 동일한 교과에 적용하였음에도 불구하고 서로 상반된 결과가 나타나고 있으므로 이에 대한 명확한 결론을 내릴 필요가 있다. 둘째, 체계적이고 압축된 지식이 필요하기 때문이다. 동일한 주제를 유사한 방법으로 수행한 연구가 반복됨으로써 야기되는 연구의 비효율성 문제가 있고, 각기 다른 관점과 이론적 틀로 플립러닝을 살펴보기에 영향력의 실제크기를 밝혀내는데 많은 제한점이 있다. 즉, 플립러닝이 전통적 교수법과 비교하여 학습자의 인지적, 정의적, 대인관계 영역에 얼마만큼 효과가 있는지 통합적인 결과를 살펴볼 필요가 있다. 셋째, 플립러닝의 효과성에 영향을 미칠 수 있는 조절변인(일반적 특성, 플립러닝 설계특성)의 영향력에 대한 분석이 가능하기 때문이다. 조절변인에 따른 효과크기를 계산할 수 있고, 이러한 결과를 반영하여 좀 더 효과적인 교육 프로그램 개발을 이룰 수 있다. 메타분석은 변수들 간의 방향에 대한 결론뿐만 아니라 그 분야에 어떤 연구가 더 필요하고 앞으로 어떤 방향으로 연구가 이루어져야 하는지에 대한 방향을 제안할 수 있다(Borenstein, Hedges, Higgins, & Rothestein, 2009). 그러므로 선행연구를 바탕으로 플립러닝 연구의 흐름을 재고하고, 메타분석을 활용하여 조절변인에 따른 플립러닝의 효과를 살펴보고, 향후 연구의 방향을 모색하고자한다. 이를 위한 본 연구의 연구문제는 다음과 같다. 1. 플립러닝이 학습에 미치는 전체 평균 효과크기(effect size)는 어떠한가? 2. 플립러닝이 학습 영역별 효과(인지적 영역, 정의적 영역, 대인관계 영역)에 미치는 평균 효과 크기 및 하위요소별 평균 효과크기는 어떠한가? 3. 조절변인에 따른 플립러닝의 평균 효과크기는 차이가 있는가? 3-1. 플립러닝의 일반적 특성에 따른 평균 효과크기는 어떠한가? 3-2. 플립러닝의 설계특성(수업전, 수업중, 수업후)에 따른 평균 효과크기는 어떠한가? 본 연구는 사전사후 실험설계와 표준화된 측정도구를 사용한 연구들 중에 본 연구가 설정한 기준에 부합하는 126편의 학술지 및 학위논문을 대상으로 하였다. 총 433개의 효과크기가 나타났으며 CMA프로그램을 활용하여 분석하였다. 분석 결과는 다음과 같다. 첫째, 플립러닝의 전체효과크기는 .41로 중간 정도로 나타났다. 플립러닝의 전체 효과크기는 통계적으로 유의한 값이자, 강의식 수업에 비해 학습효과가 높게 나타난 것이다. 이러한 결과는 플립러닝이 충분한 교육적 성과를 거두고 있다는 것으로 판단된다. 둘째, 플립러닝의 효과크기는 인지적, 정의적, 대인관계 영역에 모두 통계적으로 유의한 영향을 미치는 것으로 나타났다. 인지적 영역(.65), 정의적 영역(.51), 대인관계 영역(.68)으로 모두 중간 크기의 효과가 나타났다. 하위 영역별로 살펴보면, 인지적 영역은 비판적사고력(.71), 학업성취도(.62), 문제해결력(.49), 자기주도학습능력(.45) 순으로 효과크기가 큰 것으로 나타났다. 정의적 영역은 수업참여도(.80), 학습동기(.69), 학습태도(.59), 학습만족도(.55), 자기효능감(.44), 수업흥미(.43)의 순으로 효과 크기가 큰 것으로 나타났다. 대인관계 영역은 의사소통능력(.74), 상호작용(.59), 협동심(.56)으로 나타났으며, 모두 중간 크기의 효과가 나타났다. 그러므로 학습자의 인지적, 정의적, 대인관계 영역의 학습효과를 높이기 위해 플립러닝을 활발히 활용할 필요가 있다. 셋째, 플립러닝의 효과크기가 보여준 이질성을 유의하게 설명하는 변인으로 일반적 특성에서는 학교유형, 중심교과가, 플립러닝 설계특성에서는 실험처치기간, 동영상 제작 주체, 동영상 시간, 숙제 부여 여부, 사전 학습 확인 유무, 모둠 구성원수, 토론 시간 변인이 연구간 효과크기의 차이를 설명하는 조절변인으로 밝혀졌다. 구체적으로 살펴보면, 고등학교에서 이루어질 때, 초등학교에서는 영어, 음악, 컴퓨터 교과에, 중학교에서는 수학, 가정 교과에, 고등학교에서는 영어, 컴퓨터 교과에, 대학교에서는 과학, 사회학, 국어 교과에서 활용되고, 대학교에서는 과학, 사회 교과에서 적용될 때, 실험처치기간이 7주일 때, 동영상을 직접 제작하지 않을 때, 10분이상-15분미만의 사전 동영상이 주어질 때, 숙제가 부여될 때, 사전학습 이해도를 확인할 때, 모둠구성원수는 4명일 때, 토론시간은 20분이 주어질 때 가장 효과적인 것으로 나타났다. 그 외 연구설계, 실시횟수, 출판유형, 출판지역, 수업유형, 장애유무, 참여인원수, 사전학습을 하지 않았을 경우 대안제시 유무, 오리엔테이션 유무, 사전학습에서 자기주도적 학습활동 제공유무, 학습자 수준에 따른 학습 제시 유무, 수업후 보충/심화 과제제공 유무 등의 조절변인은 연구간 효과크기 이질성에 대한 유의한 설명력을 보여주지 않았다. 본 연구에서는 사전학습 활동설계, 면대면 수업구성, 동영상제작에 대한 설계시사점을 제공하였다. 이러한 결과를 바탕으로 플립러닝이 학습에 있어서 긍정적인 효과를 지닌 것으로 결론 내릴 수 있다. 그러나 플립러닝 메타분석 선행 연구가 부족하여 심층적인 논의를 제시하는데 어려움이 있었고, 유아나 성인은 연구대상에서 제외하여 일반화 하는 것에 한계가 있다. 또한, 전통적인 메타분석 방법의 특성상 학습효과에 영향을 줄 수 있는 여러 변인을 동시에 고려하여 효과크기를 계산하는데 한계를 가지며 학위논문과 국내연구의 비중이 많았다는 제한점을 가지고 있다.Ⅰ. 서론 1 A. 연구의 필요성 및 목적 1 B. 연구문제 3 C. 용어의 정의 4 1. 플립러닝 4 2. 메타분석 5 3. 효과크기 5 4. 학습의 영역 5 5. 조절변인 7 Ⅱ. 이론적 배경 10 A. 플립러닝의 이해 10 1. 플립러닝의 개념 10 2. 플립러닝의 현황 11 3. 플립러닝의 특징 13 4. 플립러닝의 절차 17 5. 전통적 교실과 플립러닝 교실의 비교 19 B. 플립러닝 연구동향 20 1. 플립러닝의 학습효과 관련 선행연구 20 2. 플립러닝의 학습효과 관련 메타분석연구 28 C. 플립러닝 수업 자가진단도구 33 Ⅲ. 연구방법 37 A. 연구대상 및 선정기준 37 B. 연구절차 42 1. 자료의 코딩 42 2. 데이터분석 45 3. 메타분석 보고기준 52 4. 자료 분석 도구 53 Ⅳ. 연구결과 54 1. 출판편의 분석 54 2. 동질성검증 56 3. 플립러닝의 전체 평균 효과 크기 57 4. 플립러닝이 종속변인에 미치는 평균 효과 크기 60 5. 조절변인에 따른 플립러닝의 평균 효과 크기 64 Ⅴ. 결론 및 제언 90 A. 결론 및 논의 90 B. 시사점 100 1. 연구적 시사점 100 2. 설계적 시사점 102 C. 후속 연구를 위한 제언 105 참고문헌 108 부록1. 분석 논문 목록 120 부록2. 분석 대상 논문 특징표 132 ABSTRACT 13

암페타민으로 유도한 보행성 활동량이 중격측좌핵 중심부 내의 CART 펩타이드 55-102에 의해 저해될 때 관여하는 신호전달 경로의 탐색

Department of Medical Scienceprohibition박

전자제품의 조립시간 산정을 위한 모델 개발

MasterIn these days, companies face fierce competition for survival in the global market. Price competitiveness is one of more important factor to survive, because every company pursues to manufacture high quality products. It is helpful to have the competitiveness that if we can predict and reduce product cost in product life cycle. Accordingly, this paper presents the model to estimate manufacturing cost in product development stage. Especially, we focused on developing assembly time prediction models to estimate assembly cost in manufacturing cost, as this model has not been covered in previous studies. The prediction models were established by neural network and regression models by considering assembly type for accurate time prediction. We can find and validate that the neural network models were superior to the regression models. Finally, real world case studies are presented on managing cost with predicted assembly cost