포도당으로 개시되는 연속 효소 반응에 의한 실크 피브로인의 젤화

학위논문 (석사) -- 서울대학교 대학원 : 농업생명과학대학 바이오시스템.소재학부(바이오소재공학전공), 2020. 8. 이기훈.최근 실크 피브로인 하이드로젤을 제작함에 있어 horseradish peroxidase(HRP)와 과산화수소에 의한 효소 가교 방법이 주목 받고 있다. HRP에 의한 가교로 하이드로젤을 제작하면 탄성이 있으며 투명한 하이드로젤을 제작할 수 있으나, 과량의 과산화수소가 존재하면 HRP의 비활성화가 일어난다. 따라서 본 연구에서는 직접적인 과산화수소의 부가를 피하기 위해 연속 효소 반응을 적용하여 포도당과 glucose oxidase(GOx)에 의해 실크 피브로인의 젤화를 개시하였다. 연속 효소 반응에서는 먼저 GOx가 포도당과 산소를 각각 글루코노-델타-락톤과 과산화수소로 전환시키고, 이 반응에서 생성된 과산화수소를 기질로 하여 HRP가 실크 피브로인 내의 타이로신 잔기를 산화하여 다이-타이로신 반응을 촉진한다. 연속 효소 가교 하이드로젤(SF/GOx/HRP)의 특성 분석은 크게 두 가지로 나누어, 초기 젤화 거동과 제작한 하이드로젤의 역학적 성질에 대해 살펴보았다. SF/GOx/HRP의 젤화 시간은 SF/HRP에 비해 약 2.7 배 단축되었는데, 이에 대한 자세한 분석을 위해 반응계 내에 존재하는 화합물들의 영향을 자세히 알아보았다. 그 결과, 과산화수소의 간접적인 공급으로 기존에 제기되었던 HRP의 비활성화 문제를 피할 수 있었던 것으로 생각된다. 한편, SF/GOx/HRP의 역학적 성질을 측정하였을 때 초반에는 탄성률이 낮았으나 시간이 경과함에 따라 베타 시트 구조가 발달하며 탄성률이 증가하였다. 하지만 최종적인 탄성률은 SF/HRP에 비해 낮았으며 이는 내부 구조가 비교적 조밀하게 형성되지 않았기 때문이었다. SF/GOx/HRP는 포도당이 존재할 경우에 GOx에 의해 과산화수소가 방출되는 특징을 가지고 있어 항균성이 나타났다. 이에 따라 향후 지혈제로서 활용될 수 있을 것으로 기대된다.The enzymatic crosslinking reaction by horseradish peroxidase(HRP) and hydrogen peroxide(H2O2) is getting attention for fabricating silk fibroin hydrogel. HRP-mediated crosslinked hydrogel is elastic and optically transparent, yet has the drawback of HRP inactivation by excess H2O2. In this study, the tandem enzyme reaction was applied to avoid the direct addition of H2O2, which triggered the gelation of silk fibroin by glucose and glucose oxidase(GOx). In the tandem enzyme reaction with GOx and HRP, GOx converts glucose and oxygen into glucono-δ-lactone and H2O2, and subsequently, HRP consumes indirectly provided H2O2. In consequence, HRP oxidizes tyrosine residue and induces di-tyrosine linkage of silk fibroin. The properties of serial enzymatic crosslinked hydrogels(SF/GOx/HRP) were analyzed by dividing them into two parts: initial gelation behavior and time-dependent stiffening. The effects of chemicals in the reaction system were investigated since the gelation time of SF/GOx/HRP was approximately 2.7 times shorter than SF/HRP. To sum up, the indirect supply of H2O2 can inhibit HRP deactivation. The elasticity was increased over time despite lower modulus than SF/HRP at 0 hr because of the β-sheet development. However, the final modulus of SF/GOx/HRP was lower than that of SF/HRP because the pore structure was not relatively dense. In addition, SF/GOx/HRP showed antibacterial activity because hydrogel releases H2O2 by GOx when glucose was supplied. As a result, it is expected to be used for glucose sensing hydrogel or hemostatic agent.제 1 장 서론 1 제 2 장 문헌 연구 4 2.1. 실크 피브로인 하이드로젤 4 2.1.1. 물리적 가교법 4 2.1.2. 화학적 가교법 5 2.1.3. 물리화학적 가교법 9 2.2. Horseradish peroxidase에 의한 효소 가교 10 2.2.1. Horseradish peroxidase 가교 기작 10 2.2.2. Horseradish peroxidase 가교 실크 피브로인 하이드로젤 13 2.2.3. 기질의 다변화-연속 효소 반응 14 제 3 장 재료 및 방법 16 3.1. 재료 16 3.2. 실크 피브로인 용액의 제조 16 3.3. 효소 가교 실크 피브로인 하이드로젤 및 동결건조 스펀지의 제작 17 3.4. 초기 젤화 거동 19 3.5. 효소 반응속도론적 분석 22 3.6. 역학적 특성 23 3.7. 물 함유량 측정 24 3.8. 감쇠 전반사 푸리에 전환 적외선 분광 분석 25 3.9. X-선 회절 분석 27 3.10. 전계 방사형 주사 전자 현미경 27 3.11. 과산화수소 방출 분석 28 3.12. 항균성 평가 28 제 4 장 결과 및 고찰 30 4.1. 효소 가교 실크 피브로인 하이드로젤의 제작 31 4.2. 효소 가교 실크 피브로인 하이드로젤의 초기 젤화 거동 32 4.2.1. 젤화 시간 및 가교 속도 32 4.2.2. 실험 조건 내 인자의 젤화 시간에의 영향 37 4.2.3. 실크 피브로인의 효소 활성에의 영향model study 41 4.2.4. 기질 농도 조건 변화 44 4.2.5. 효소 농도 조건 변화 48 4.3.효소 가교 실크 피브로인 하이드로젤의 역학적 특성 분석 51 4.3.1. 점탄성 및 역학적 특성 53 4.3.2. 물 함유량 58 4.3.3. 이차 구조 전이 60 4.3.4. 형태학적 특성 64 4.4. 효소 가교 실크 피브로인 하이드로젤의 항균 특성 분석 66 4.4.1. 과산화수소 방출 거동 66 4.4.2. 항균성 시험 68 4.5. 효소 가교 실크 피브로인 하이드로젤의 응용분야 제언 71 제 5 장 결론 73 참고문헌 75Maste

Novel Therapeutic Approaches in Basal-like Breast Cancer and Alzheimer’s Disease

Part I. Calpain 2 Enhances Mesenchymal Shift Through the HIF1α-Twist Axis in Triple Negative Breast Cancer Cells Breast cancer is highly ranked as one of the most common cause of cancer death. Although Basal-Like Breast Cancer (BLBC) is not the major subtype of breast cancer in population, it is responsible for a disproportionate share of mortality with higher grade tumors and higher rates of distant recurrence. Because most of the BLBC patients represent resistance to conventional chemotherapies, new approaches are urgently needed to improve therapeutic outcome in BLBC treatment. Calpain, a family of calcium-dependent cysteine proteases, has a wide range of cellular functions related to cancer, including functions in apoptosis, hypoxia, proliferation, migration and invasion. The correlation between m-calpain (calpain 2) expression and the clinical outcome in BLBC was investigated using the database analysis. Calpain 2 knock-down cellular model was constructed using mesenchymal BLBC cell lines. Changes in the cellular morphology, proliferation rate, colony forming ability and migration and invasion capacities of calpain 2 knock-downed (KD) cells were compared to those of empty vector transduced cells. Calpain 2 KD cells showed cobblestone like shape with increased cellular circularity, reduced anchorage-dependent and -independent growth, and downregulation of migration and invasion compared to empty vector transduced cells. EMT related gene expression was also investigated. EMT was reversed by calpain 2 KD. Among the EMT related transcription factors, only Twist showed consistent reduction in protein and mRNA levels. HIF1α, a transcription factor which is known to directly bind to Twist promoter, was investigated for its subcellular localization and binding to HRE (Hypoxia-Response Element) in Twist promoter using the immunofluorescence assay and ChIP assay, respectively. The percentage of HIF1α in the nuclear fraction was decreased by calpain 2 KD. The interaction between HIF1α and HRE of Twist promoter was also inhibited by calpain 2 KD. Hypoxia-induced Twist expression was diminished by calpain 2 downregulation. Calpain 2 re-expression by transient transcription recovered mesenchymal property with downregulation of ZO-1 level. Moreover, filamin A cleavage was also decreased by calpain 2 KD. The interaction between HIF1α and C-terminal fragment of filamin A was decreased. Anoikis sensitivity in calpain 2 KD cells was investigated using WST assay, Annexin V/PI double staining, and immunoblotting analysis. Calpain 2 downregulated cells obtained anoikis sensitivity. The results indicate that calpain 2 could play an important role in EMT process via HIF1α translocation, followed by Twist expression. Calpain 2 might serve as a novel target for therapeutic strategies of BLBC patients. Part II. Development of Dual Inhibitor Against μ-Calpain Enzymatic Activity and Aβ Aggregation μ-Calpain, a calcium-dependent cysteine protease, is hyper-activated when the intracellular calcium homeostasis is disrupted in Alzheimer’s disease. Hyper-activation of μ-calpain increases the expression level of β-secretase (BACE1) and, consequently, enhances the accumulation of β-amyloid (Aβ) peptide leading to extracellular senile plaques. Also, activated μ-calpain induces hyper-phosphorylation of tau along with the formation of neurofibrillary tangle (NFT) through p35 cleavage into p25. The accumulation of Aβ peptide and the formation of NFT are the major mechanisms of neurodegeneration in AD. To find the novel μ-calpain inhibitor, we screened the chalcone derivatives. Among them, CNa 5 showed inhibitory activity to μ-calpain in experiment using recombinant enzymes and the enzyme-overexpressed cellular lysate. CNa 5 effectively inhibited expression of BACE1, formation of Aβ peptide, cleavage of p35 to p25, and phosphorylation of tau under the condition of oxidative stress. μ-Calpain inhibitory activity of CNa 5 was confirmed by docking study, as the compound was suited at the active site of μ-calpain. CNa 5 had exceptionally strong neuroprotective activity when considering the calpain inhibitory potency. For this reason, inhibitory activity of Aβ aggregation was evaluated. CNa 5 inhibited β-sheet aggregates formation which was confirmed using ThT (Thioflavin T) staining and CD (Circular Dichroism) spectroscopy and docking study showed the possible binding mode of CNa 5 to Aβ pentamer. Thus, we concluded the novel chalcone derivative, CNa 5, is a potent drug candidate for the treatment of AD by inhibiting both μ-calpain and Aβ aggregation.;기저형 유방암은 유방암의 아형 중 높은 전이 및 재발률과 더불어 가장 좋지 않은 예후를 가지는 아형이다. 기저형 유방암 환자는 표적 치료를 위한 표적 단백질을 발현하지 않으며 그 예후가 나쁘기 때문에 새로운 치료 전략의 수립이 필요한 실정이다. Calpain은 칼슘 의존적 프로테아제로, 종양과 관련된 다양한 세포 기능 전반에 걸쳐 주요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 calpain 2 발현과 기저형 유방암의 임상 결과와의 상관성을 데이터베이스 분석을 통하여 확인하였다. 데이터베이스 분석에서 calpain 2의 발현은 기저형 유방암의 아형 특이적으로 위험(risk)를 증가시켰으며 상피간엽이행 관련된 다양한 유전자의 발현과 상관관계를 나타냄과 동시에 기저형 유방암의 생존과도 밀접한 연관성을 나타내었다. 데이터베이스 분석 결과를 바탕으로 간엽성 특징을 가지는 기저형 유방암 세포주에서 calpain 2을 선택적으로 침묵시킨 세포 모델을 확립하였고 그에 따른 표현형의 변화를 확인하였다. Calpain 2를 침묵시킨 세포 모델에서 세포의 형태와 부착 의존적 및 비의존적 세포 증식 속도의 변화를 확인하였다. 이와 더불어 calpain 2 침묵 세포에서 세포의 이동성 및 침습성의 감소를 확인하였으며 이를 바탕으로 상피간엽이행과 관련된 표지 단백질의 변화를 확인하였다. Calpain 2 침묵 세포에서 상피간엽이행 관련 단백질 중 상피성 표지 단백질은 증가하고 간엽성 단백질은 감소하는 양상이 확인되었고 해당 단백질의 mRNA 수준에서도 유사한 결과를 나타내었다. 또한, 상피간엽이행 표지 단백질의 발현을 조절하는 다양한 관련 전사인자들의 발현을 조사하였을 때 Twist의 발현만이 특이적으로 calpain 2 침묵 세포에서 감소하는 것이 관찰되었다. Twist 발현의 변화는 mRNA 수준에서도 확인되었기 때문에 Twist의 발현을 조절하는 전사인자인 HIF1α의 세포 내 분포를 조사하였다. HIF1α는 세포질에서 핵으로 이동함으로써 그 활성이 증가하게 되는데 calpain 2를 침묵시킨 세포에서 핵 내 HIF1α의 분포가 현저히 낮게 나타났다. 이러한 변화는 CoCl2로 유도된 HIF1α의 활성화에 의한 Twist의 mRNA 수준 변화로도 확인되었는데, calpain 2 침묵 세포에서는 CoCl2에 의한 Twist mRNA 증가가 관찰되지 않았다. 이와 더불어 calpain 2 침묵 세포에서는 HIF1α와 Twist의 promoter 상의 HRE 부분과의 상호작용이 현저히 줄어드는 것이 확인되었다. Calpain 2 침묵 세포에서 다시 calpain 2를 발현시켰을 때 상피성 표지 단백질인 ZO-1의 발현이 감소하였으며 HIF1α의 세포 내 분포를 결정짓는데 중요한 단백질인 filamin A의 절단도 calpain 2 침묵 세포에서 감소하였던 것이 다시 증가되는 양상을 확인하였다. 절단된 filamin A와 HIF1α의 상호작용이 calpain 2 침묵 세포에서 감소되는 것이 관찰되었으며 실제 종양 조직에서와 유사한 배양 조건인 삼차원적 배양에서도 Twist의 발현이 감소되는 것을 관찰할 수 있었다. Calpain 2와 종양 전이와 관련하여 상피간엽이행 뿐만 아니라 비부착 상태에서 유도되는 세포 사멸인 아노이키스와의 연관성도 확인하였다. Calpain 2 침묵 세포는 부유 배양 시 생존율이 감소되는 양상을 나타내었으며 세포 사멸 관련 단백질의 발현변화와 세포 사멸을 확인하기 위한 Annexin V/PI 염색을 이용한 실험 결과에서도 calpain 2 침묵 세포에서 더 많은 세포 사멸이 유도됨을 관찰하였다. 이는 calpain 2 를 감소시킴으로써 아노이키스에 대한 감수성을 획득할 수 있음을 시사하는 결과이다. 결론적으로 calpain 2의 발현을 조절하는 것은 상피간엽이행에서의 Twist를 조절하고 아노이키스에 대한 감수성을 획득시킴으로써 새로운 치료 표적으로써의 높은 개발 가능성을 보여준다. μ-Calpain (Calpain 1)은 알츠하이머 병에서 무너진 칼슘 항상성에 의해 과활성화되는 것으로 알려져있다. μ-Calpain의 과활성화는 β-secretase (BACE1)의 발현을 증가시킴으로써 β-amyloid의 축적을 유도한다. 또한, CDK5의 조절자인 p35 단백질을 p25로 잘라 CDK5의 활성을 지속적으로 유지시키고 그에 따라 tau 단백질의 과인산화를 초래함으로써 neurofibrillary tangle (NFT)의 형성을 유도한다. β-Amyloid 축적에 의한 β-amyloid의 응집과 NFT의 형성은 알츠하이머 병에서 가장 잘 알려진 두 가지 발병 기전으로 μ-calpain은 그 두 가지 기전을 유기적으로 연결하는 주요한 치료 표적이다. 새로운 μ-calpain 저해제를 개발하기 위하여 일련의 chalcone 유도체를 스크리닝 하였고 그 중 CNa 5는 μ-calpain 저해능을 나타냄과 동시에 매우 높은 신경세포 보호 효과를 나타내었다. CNa 5는 BACE1의 발현을 억제하고 β-amyloid의 형성을 저해하였으며 p35가 p25로 절단되는 것을 막아 tau의 인산화를 억제하였다. 이러한 효과는 μ-calpain 억제 효능을 통하여 나타나는 것으로 예상되며 μ-calpain의 직접적 억제 효과는 docking study를 통하여 μ-calpain의 활성부위에 직접 CNa 5가 작용함으로써 나타나는 효과임을 규명하였다. CNa 5의 신경세포보호효과는 μ-capain의 억제 효능을 고려할 때 매우 강력했기 때문에 β-amyloid의 응집에도 관련이 있을 것으로 예상되어 이를 조사하였다. CNa 5는 β-amyloid가 응집되면서 나타내는 베타병풍구조(β-sheet)의 형성을 억제하였고 이를 Thioflavin T 염색과 원편광이색성(Circular Dichroism)을 조사함으로써 평가하였다. 또한 docking study를 통하여 CNa 5가 β-amyloid의 오량체(pentamer)와 결합하는 양상을 확인함으로써 그 가능성을 평가하였다. 결과적으로 새로운 chalcone 유도체인 CNa 5가 알츠하이머 병에서 μ-calpain의 효소 활성을 억제함과 동시에 β-amyloid의 응집을 저해함으로써 새로운 치료제로써의 가능성을 나타내었다.PART I : Calpain 2 Enhances Mesenchymal Shift Through the HIF1α-Twist Axis in Basal-like Breast Cancer Cells 1 I. Introduction 2 A. Breast cancer 2 1. General information of breast cancer 2 2. Classification of breast cancer 2 3. Triple negative breast cancer 4 4. Basal-like breast cancer 6 B. Calpain 7 1. Structure of calpains 7 2. Regulation of calpains 8 3. Calpain and cancer 9 C. EMT and anoikis in cancer metastasis 15 1. Epithelial-mesenchymal transition 17 2. Anoikis 21 II. Materials and methods 24 A. Database analysis 24 B. Cell cultures 25 C. Lentivirus-mediated small hairpin RNA interference 25 D. Western blot analysis 26 E. Cellular circularity calculation 27 F. Cellular viability assay 27 G. Live cell counting 28 H. Clonogenic assay 28 I. Forced suspension culture 28 J. Soft agar colony formation assay 29 K. Transwell migration/invasion assay 29 L. Wound healing assay 30 M. Immunofluorescence 30 N. Quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) 31 O. Subcellular localization calculation of HIF1α 32 P. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay 33 Q. Immunoprecipitation assay 33 R. Annexin V/PI double staining apoptosis assay 34 S. Statistical analysis 35 III. Results 36 I-A Calpain 2 expression correlates with risk and expressions of mesenchymal markers in BLBC patients 36 I-B Calpain 2 expression, not calpain 1, correlates with survival in BLBC patients 40 I-C Calpain 2 knock-downed BLBC cells show morphological and phenotypical changes 42 I-D Calpain 2 downregulation reversed EMT in BLBC cells 50 I-E Increased Twist gene expression mediated by calpain 2-dependent cleavage of filamin A (FLNA) which consequently induces nuclear translocation of HIF1α 56 I-F Calpain 2 downregulated BLBC cells were sensitized to anoikis 61 IV. Discussion 65 References 74 PART II : Development of Dual Inhibitor Against μ-Calpain Enzymatic Activity and Aβ Aggregation 92 I. Introduction 93 A. Alzheimers disease 93 1. General information of Alzheimers disease 93 2. Treatment of Alzheimers disease 93 3. New drug development of Alzheimers disease 103 B. Calpain system in Alzheimers disease 105 II. Materials and methods 111 A. Cell cultures 111 B. Immunofluorescence 111 C. Western blot analysis 112 D. Docking study 113 E. Thioflavin T assay 113 F. Circular dichroism spectroscopy 114 G. Statistical analysis 114 III. Results 115 II-A CNa 5 showed potent neuroprotective activity against ROS-induced SH-SY5Y cell membrane damage 115 II-B CNa 5 showed μ-calpain inhibitory activity in SH-SY5Y cells with ROS-induced calpain activation 117 II-C CNa 5 bound to the active site of μ-calpain 119 II-D CNa 5 directly inhibited Aβ aggregation 121 IV. Discussion 125 References 129 Abstract(in Korean) 140 Appendix Publications List 14

SDIM(Synthetic design image management)시스템을 중심으로

현대는 무한경쟁의 시대이다. 산업혁명 이래 계속되어온 대량생산기술 발전에 의한 기술의 평준화로 제품의 기술적 차별성은 점차 사라지고, 실용목적으로만 구매의 대상이 되어왔던 제품은 산업사회의 성숙기를 거쳐 개개인의 취향과 감성을 표현하는 수단으로서 엄청난 소비를 창출하고 있다. 과거 공업화가 가져다준 생활의 물적·양적 풍요로움에 이외에 정보와 문화를 통하여 새롭게 창출되는 감성적이고 정서적인 가치가 중요시 되는 사회로의 전환이 이루어지고 있는 것이다. 이에 소비자가 구매의사 결정을 수행함에 있어서 제품의 기능이나 특성뿐만 아니라, 그 제품을 소유함으로써 얻게 되는 이미지도 중요한 가치로서 작용하게 되었다. 이러한 시장의 상황에서 기업의 경영전략상 디자인이 중요한 요소로 자리잡았으며, 새로운 천년을 준비하는 오늘날 디자인의 개념은 사용가치 에서 기호가치로의 변화, 문화용품의 선호경향, 물적 재화에 서비스가 결합된 복합개념의 출현, 가치의존에서 탈피한 가치창조의 개념, 동질성 감각에서 이질성 감각의 추구로 그 개념이 변화하여 기업이미지를 포함한 이미지의 창출이 새로운 상품가치로 부각되고 있다. 기업이 차별화를 획 득하여 경쟁우위를 차지하기 위해서는 새로운 소비자감성에 응답할 수 있는 새로운 전략이 필요한 것이다. 어느 한 기업의 이미지는 소비자가 특정제품과 접촉하게 된 경우에 이를 통해 가지게 된 마음속의 심상으로써 제품의 특성에 대한 충분한 식별력을 가지지 못하는 일반 소비자가 제품을 선택하게 하는 판단의 기준이 되며 그 기업에 관계된 모든 제품에 대하여 광범위하고도 지속성 있게 영향을 미치므로서 제품의 구매 및 기업의 성패를 좌우하는 중요한 변수가 되고 있다. 만일 가격 품질 등이 비슷한 여러 경쟁 회사의 제품 가운 데에서 고객이 어느 특정 회사의 제품을 선택했다면, 그것은 좋은 기업 이미지 때문이라고 할 수 있다. 따라서 기업이미지는 비슷한 유형의 제품과 서비스를 제공하는 경쟁사들이 각축하고 있는 환경 속에서 기업의 경쟁력을 높여주는데 있어 아주 유용한 수단이 되고 있는 것이다. 그러나 대부분의 기업에서는 기업이미지 광고나 기업심볼, 로고 등의 형성과 활용을 통하여 기업이미지의 관리가 이루어지는 것으로 생각하고, 소비자와의 직접적인 커뮤니케이션 수단이 되는 제품의 이미지나 제품의 패키지, 매장환경, 판촉서비스, 광고 등의 요소에 의해 형성되는 기업이미 지의 중요성을 간과하고 있다. 단순히 상품을 디자인하는 것이 아니라 다양화되는 소비자의 생활습관이나 가치관을 조사·분석하고 이를 통하여 소비경향을 파악함과 동시에 기업의 이미지를 형성해 나가는 디자인 컨셉을 설정하여 이를 제품개발의 전 과정에서 일관되게 적용함으로써 진정한 의미의 기업이미지 관리가 이루어지는 것이다. 본 연구에서는 디자인이 기업의 하부구조에서 이루어지는 지엽적이고 소극적인 활동이 아니라 기업경영의 전략적 수단으로 적극 활용되고 있는 오늘날, 모든 디자인 활동이 일관성 있는 조형적 특징을 형성할 수 있도록 조절해 줌으로써 소비자로 하여금 호혜적인 기업이미지를 형성하도록 하는 통합적 디자인 이미지 관리의 방법을 제시하였는데, 이는 제품, 패키 지, 매장, 디스플레이, 인쇄물, 광고 등 어떤 기업의 디자인 활동이 일관성 있는 조형적 특성을 유지할 수 있도록 종합적으로 관리하여 그 상관관계를 올바르게 조절 해줌으로써 기업이미지 형성에 중요하게 작용하는 디자인 요소들이 서로 상승효과(Synergy)를 거둘 수 있도록 일련의 원칙을 제공해 주는 틀이라고 할 수 있다. 이를 신제품개발 프로세스에 적용함으로써 여러 가지 디자인들이 일관성 있는 동질성을 갖게 되고 기업 나름의 개성이 생겨나게 되는 것이 다. 대중은 동질성이 있는 디자인을 접하면서 자연스럽게 그 기업에 대한 관심과 호감을 갖게 된다. 체계적인 디자인 이미지 관리를 통한 기업 이미지의 효과적인 조절은 기업이 경쟁사들이 각축을 하고 있는 시장환경 속에서 차별우위를 획득할 수 있도록 해주는 중요한 요소이므로 기업의 장기적인 사업 계획, 기술 개발 계획, 마케팅 계획과 병행하여 기업이미지 관리계획이 이루어져야 하며 이 과정에서 디자인의 적극적인 참여가 요구되는 것이다.;These are called the days of unlimited competition. Since the Industrial Revolution all the products are losing its own superiority in terms of technical edges due to universal parity while on the other generating tremendous amount of consuming motives as a medium for representing each consumers preference and taste. We are in the process of being transformed into a society where refined culture and valuable information create newer values for each product as well as traditional value of abundance brought to us by industrialization. Therefore the prestige and the image carried upon by owning a product play significant role for consumers in making decisions at the time of purchase along with conventional factors such as functions and characteristics of product. In the modern consumer market every enterprise realizes that design calls for serious consideration when it comes to devising marketing strategies. The concept of design at the turn of 21st century takes on new meanings with emphasis on taste values, preference of cultural products, composite values of material and services, value creating rather than value dependent and heterogeneous values. Consequently it is safe to say that any company seeking upper hand in competition is in dire need of differentiating itself by creating its own corporate image with above mentioned design concept. A corporate image has become a weighty variable in determining its economic success since it can help indecisive consumers to purchase its products solely based on company image but also exert a favorable influence upon company products for extended period of time. It works as essential means of enhancing business competitiveness in the market where each and every company is boasting near identical products and equally attractive services. However, a good deal of companies miss out the importance of company image created by product image, package, store furnishing, promotion materials and advertising which are first hand communication tools with consumers. Because they think that corporate image management can be achieved through concentrating on designing company logos and symbols. In a true sense managing corporate image should starts with surveying and analyzing target consumers lifestyles and the senses of values. And the acquired information will enable the company to find out consuming trends and eventually utilize this design concept throughout the processes of product development. Since the modern design concept is being actively used as strategical means not as passive happenings in lower bracket of company hierarchy, the need for synthetic design image management has become more imminent than ever before if a company is to create consistent and reciprocal company image for consumers. This study is about how to manage the corporate image without losing consistency or synthesis and what to do with design activities like product design, package, store design, displaying, promotion prints and advertising in order for all these design factors to achieve synergy effects. By following these guidelines a company will possibly be able to produce its own unique designs with consistency and piques interests and attentions from consumers. Effective control over corporate image through systematic design image management can be one of the few most significant factors for gaining precious edges in the business world. Thus long term business planning, development of technology and marketing planning must be done in cooperation with management planning of corporate image and design concept.논문개요 I. 서론 = 1 A. 연구의 목적 = 1 B. 연구의 내용 및 방법 = 3 C. 개념정의 = 4 II. 기업이미지의 본질 = 6 A. 이미지의 이론적 고찰 = 6 1. 정의 및 특징 = 6 2. 이미지의 기능 = 11 B. 기업이미지의 이론적 고찰 = 12 1. 기업이미지의 정의 = 13 2. 기업이미지의 구성요소 = 15 가. 상징적 이미지 = 16 나. 행태적 이미지 = 17 C. 기업이미지의 영향요인 = 18 1. 기업이미지 형성의 영향요인 = 18 2. 기업이미지 변화의 영향요인 = 21 D. 기업이미지의 중요성 = 23 III. 기업이미지 관리와 CI = 25 A. 기업이미지 관리의 기본개념 = 25 1. 기업이미지 관리의 정의 및 특성 = 25 2. 기업이미지 관리의 필요성 = 27 3. 기업이미지 관리의 유형 = 31 B. CI의 본질 = 33 1. CI의 정의 = 33 2. CI 개념의 변천 = 35 C. 기업이미지 관리에서 CI의 기능 및 역할 = 38 D. 기업이미지 관리에서 CI의 중요성 = 39 E. 일반적 CI의 프로세스 = 40 IV. 기업이미지와 제품이미지 = 45 A. 제품이미지의 본질 = 45 1. 제품이미지의 정의 = 45 2. 제품이미지의 의의 및 기능 = 47 B. 기업이미지와 제품이미지의 관계 = 49 C. 기업이미지 관리와 PI = 53 1. PI의 정의 = 53 2. PI의 기능 = 54 V. 기업이미지 관리 전략으로서의 통합적 디자인 이미지 관리체계 = 57 A. 디자인 환경의 변화 = 58 1. 디자인의 역할 변화 = 58 2. 디자이너 역할의 변화와 확대 = 61 3. 디자인의 전략적 역할 = 66 B. 통합적 디자인 이미지 관리의 개념 = 69 1. 통합적 디자인 이미지 관리의 필요성 = 69 2. 통합적 디자인 이미지 관리의 정의 = 72 C. 통합적 디자인 이미지 관리의 구성 = 73 1. 기존 기업이미지 관리의 구성요소 = 73 가. 기본 시스템 = 76 나. 응용 시스템 = 79 2. 통합적 디자인 이미지 관리(SDIM)의 구성요소 = 81 VI. 신제품 개발과 통합적 디자인 이미지 관리(SDIM)의 활용 = 87 A. 신제품 개발의 이해 = 87 1. 신제품 개발에 관한 이론적 배경 = 87 2. 제품수명주기 = 91 3. 신제품 개발의 중요성 = 94 B. 신제품 개발 유형 및 디자인 프로세스 = 94 1. 신제품 개발의 유형 = 94 2. 디자인 프로세스 = 101 C. 통합적 이미지 관리(SDIM)의 프로세스 = 104 1. 통합적 이미지 관리(SDIM)의 체계 = 104 2. 통합적 이미지 관리(SDIM) 프로세스 = 108 VII. 결론 = 113 참고문헌 = 120 Abstract = 12

Exploring the Mediating Effects of Ego-resiliency, Cognitive Triad in the relation between Parenting behaviors and Life Satisfaction

본 연구에서는 부모의 양육행동과 청소년의 삶에 대한 만족의 관계를 청소년의 자아탄력성과 인지삼제가 매개하는지 알아보았다. 이를 위해 부모의 양육행동이 청소년의 탄력성발달에 영향을 주고 자아탄력성이 자기존중감과 세상에 대한 긍정적인 견해 그리고 미래에 대한 희망에 영향을 미치며 자신의 삶에 대해서도 더욱 만족한다는 기존의 연구를 토대로 연구 모형을 설정하였다. 연구의 참여자는 서울시에 위치한 중학교 1학년 남여학생 159명이었고, 이들을 대상으로 부모양육행동의 구성변인인 부모애착, 부모감독, 학대와 자아탄력성, 자기존중감, 세상에 대한 견해, 미래에 대한 희망 척도 및 인구통계학적 질문을 포함하여 설문을 실시하였다. 수집한 자료를 분석한 결과는 다음과 같다. 첫째, 부모양육행동과 청소년의 삶에 대한 만족간의 관계에 있어 부모양육행동이 청소년의 자아탄력성뿐만 아니라 인지삼제에도 직접적인 영향을 주는 것으로 확인되었다. 둘째, 최종경로모형에서 변인들 간의 매개효과를 검증한 결과를 살펴보면, 부모의 양육행동과 청소년의 삶에 대한 만족간의 관계에 있어 청소년의 인지삼제 중 세상에 대한 긍정적인 견해, 미래에 대한 희망 변인이 각각 완전매개하는 것으로 나타났다. 또한 청소년의 자아탄력성과 세상에 대한 긍정적인 견해, 청소년의 자아탄력성과 미래에 대한 희망 변인도 부모양육행동과 청소년의 삶에 대한 만족에 있어 이들 간의 관계를 완전매개하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 부모의 지지적인 양육이 세상에 대한 긍정적인 견해와 미래에 대한 희망을 통해 청소년이 자신의 삶에 대해 만족할 수 있도록 한다고 해석할 수 있다. 또한 부모양육의 질이 높을수록 청소년의 자아탄력성 발달에 긍정적인 영향을 주며 세상에 대해서도 더욱 신뢰롭고 긍정적으로 지각하고 따라서 자신의 삶에 대해 더욱 만족하는 것으로 해석할 수 있다. 마찬가지로 청소년의 자아탄력성과 미래에 대한 희망이 매개하는 결과를 해석해보면 부모양육행동과 청소년의 자아탄력성은 정적인 관계가 있으며 높은 자아탄력성을 보고한 청소년일수록 현재의 문제를 해결할 수 있다는 자신감이 있고 자신의 목표를 향해서 나아가고 있다고 생각하며 자신의 삶에 대해서도 더욱 만족하는 것으로 나타났다. 종합해보면, 부모양육의 질이 높은 청소년일수록 문제 상황이나 역경에서 더 빨리 회복할 수 있는 능력을 나타내는 자아탄력성이 높으며 이러한 청소년은 세상에 대해서도 긍정적으로 지각하고 미래에 대해서도 더 희망을 갖고 있다고 볼 수 있다. 본 연구의 결과를 토대로 상담 장면에서 생각해 볼 수 있는 함의는 다음과 같다. 생애 초기, 부모양육의 질이 낮을수록 청소년은 타인과 세상에 대해서도 기본적인 신뢰를 형성하지 못할 수 있으며 자신의 미래에 대해서도 비관하며 현실적인 문제 대처 능력을 키우지 못했을 가능성이 있다. 상담자는 청소년 내담자에게 상담자와의 기본적인 신뢰를 바탕으로 청소년 내담자가 타인과 세상에 대해서 적대적으로 지각하지 않도록 도와주며, 문제가 있을 때 타인에게 도움을 요청할 수 있다는 것을 알게 하는 것이 중요하다. 또한 청소년들에게 자신에게 맞는 목표를 설정하고 어려움이 닥쳤을 때 구체적인 문제해결방략을 같이 생각해보고 실행할 수 있게 하여 미래에 대해서 긍정적으로 지각할 수 있도록 도와주는 것이 필요하다고 할 수 있다.;The Present study tested the mediating role of ego-resiliency and cognitive triad between the relationship of parenting behaviors with life satisfaction of youth. Previous studies have demonstrated the positive relationship of parenting behaviors, ego-resiliency with physical and psychological health. The path model and mediation analyses were conducted based on 159 middle school students in Seoul. The questionnaires were composed of the Korean version of parenting behaviors including parent attachment, parent monitoring and abuse, ego-resiliency, self-esteem, view of the world, hope and demographic information. The results of data analysis were summarized as follows: First, the research model supposed that the parenting behaviors had direct effect on cognitive triad as well as ego-resiliency of youth. Second, not only view of the world and hope for the future but also ego-resiliency, view of the world and ego-resiliency, hope for the future fully mediated the relationship between parenting behaviors and life satisfaction of youth. In summary, high quality of parenting significantly related to developing ego-resiliency, positive cognition about the world and the future. The implications for the counselors based on the results of this study are as follows. Early in life, having lower the quality of the parenting style, basic trust for others and the world can not be formed and the youth would be raised pessimistically about their future. Basic trust in the counselors for adolescent clients, they are not to perceive as hostile to others when they have a problem. It also may be necessary to help young people set their goals and think about the difficulties in the specific problem-solving strategies and able to run in the future so that it can be perceived as positive.I. 서론 1 A. 문제제기 1 B. 연구문제 4 II. 이론적 배경 5 A. 부모양육행동 5 1. 부모애착 5 2. 부모감독 및 학대 6 B. 자아탄력성과 인지삼제 7 1. 자아탄력성 7 2. 인지삼제 9 3. 자아탄력성과 긍정적인 인지삼제 11 C. 자아탄력성, 긍정적인 인지삼제와 삶에 대한 만족 11 III. 연구모형 13 A. 연구모형 13 B. 연구가설 14 IV. 연구방법 15 A. 연구대상 15 B. 연구절차 15 C. 측정도구 15 1. 부모양육행동 척도 15 2. 자아탄력성 척도 16 3. 인지삼제 척도 16 4. 삶에 대한 만족 척도 17 D. 자료 분석 방법 18 V. 연구결과 20 A. 주요 변인의 기술통계 및 상관분석 결과 20 1. 주요 변인의 기술통계 결과 20 2. 주요 변인의 상관분석 결과 21 B. 연구모형 검증 23 1. 모형의 적합도 평가 23 2. 매개효과 검증 25 VI. 논의 28 A. 요약 및 해석 28 B. 연구의 의의 및 제언 30 참고문헌 33 부록 39 Abstract 4

INSTALLATION OF ENVIRONMENTAL ORIENTATION THROUGH TEXTILE SCULPTIRE : ON THE BASIC OF WORK MANUFACTURING

The artistic expression of the contemporary brings a radical change with its complexive and variable modes over control. there, it is sure, an expension of domains in relation to overall existing concepts, values etc., and, besides, an experimental spirit of creative will that may be titled "noeteric" appear as vivid consciousnesses than ever. In this circumstances, as a new methodology in new objects directly influenced from experiments in objects, greatly emphasized recently is the 'installation':it has no concrete form, it is intactly revealed as it is, it aims to diffusion of image and the mutal spread of it, and it appear as an expressional mode in space. And this current has made fiber artists consider fiber as the means for aesthetic exprtssion or something beyond practical meaning, and also, has had them develop such installation as the works of the indivisualized or the environmental, not from the concept of production, but from the concept of creation. This installation as soft 'textile sculpture' possessing the three-dimensional space grows as an independent indivisual to be solely become a new environmental art, that is, as an independent formative work manifesting new realities. In this study, a focus has been paid to an illumination of the concepts of fiber art that is reinterpreted today, and that of the formative characteristics of the installation of a predominantly environmental orientation through textile sculpture. The contents consists of investigations into the formative characteristics by the rise and development of fiber installation and a comparative analysis of it with the formativity in my own installation works. For the method of the study, survey in exhibitions of environmental installation works, analysis of reference materials, and also comparative analysis between them and my works were conducted. As the results, formative characteristics of fiber installation are as follows: First, it takes on the formativity of totality. Second, it is of progress and process. Third, it is of the time. Fourth, it is formed of scattered pieces. Fifth, it is dilivered from institutional modes and avoid illusion with its approached or spread into apperance of image. Sixth, it performs an atmospheric art by means of the space search of environmental orientation, and maximize empathy in order to orient to participant art. Lastly, it develops into a kind of public art by grafting together purith and utility, and aims to a technological art which advocates scientific environments by mobilizing an engineering stadpoint of the contemporary, newest science.;현대의 예술표현은 걷잡을 수 없이 복잡하고 다양한 양상으로 급격한 변화를 가져오고 있다. 거기에는 물론 기존의 개념, 가치 등 모든 것 들에 대한 영역확장과 더불어 '새로움'이라는 실험정신과 창조의지가 과거 어느때 보다도 활기찬 의식으로써 나타나고 있다. 이런 양상속에서 오브제(Object)의 실험이 가져온 직접적인 영향과 새로운 소재 및 방법론으로써 구체적인 형태를 갖지 않는 상태를 그대로 펼쳐 놓아 이미지 확산과 상호확대를 꾀하는 공간속에서 하나의 표현양식으로 나타나는 설치작업(Installation)이 근래에 크게 강조되고 있다. 이런 조류에 의하여 현대 섬유예술가들도 섬유를 실용적 의미의 차원을 넘어 미적표현의 수단으로 생각하게 되었고 대량생산 수단이 아닌 창작개념을 갖고 개성적이고 개별화된 작품이나 환경작품의 Installation으로 전개시키게 되었다. 그것은 공간을 점유하고 있는 3차원의 부드러운 섬유조각(Textile Sculpture)으로서 스스로 독립된 하나의 환경조형(Environment Plastic) 작품으로 새로운 현실을 주장하게 된 것이다. 본 논문에서는 현대에 재해석되는 섬유예술의 개념과 Textile Sculpture를 통한 환경지향의 Installation의 조형적 특성을 규명하는데 그 목적을 두었다. 본 연구의 내용은 Fiber Installation의 발단과 전개에 의한 조형적 특성을 밝히고 본인의 설치작업 작품의 조형성과 비교 분석 연구하였다. 본 연구의 방법은 환경적 설치작업 전시회와 국내외 참고문헌을 분석함에 따라 본인의 작품과 비교 분석하였다. 연구 결과 Fiber Installation의 조형적 특성은 첫째, 총체적(Totality) 조형. 둘째, 진행, 과정성(Process)의 조형. 셋째, 일회적 조형. 넷째, Scatter Piece로 형성된 조형. 다섯째, 제도적 양식에서 해체되어 새롭고 신비적인 공간을 의식한 이미지의 확대와 접근으로서 Illusion을 무효화 한다. 여섯째, 환경지향의 공간 탐색을 통하여 분위기 예술을 연출하며, 참여예술로서 지향하기 위하여 감정 이입을 극대화 한다. 일곱째, 순수와 실용을 접목시켜 대중예술로 발전시키며, 현대 첨단과학의 공학적 입장을 동원하여 과학적 환경을 주장하는 공학예술을 지향한다고 하는 여러 복합적인 요인이 내재되어 있다는 것을 뚜렷하게 찾아볼 수 있었다.목차 = Ⅲ 논문개요 = Ⅶ Ⅰ. 서론 = 1 A. 연구의 목적 = 1 B. 연구 방법 및 내용 = 2 Ⅱ. 이론적 배경 = 3 A. 현대섬유예술의 개념 = 3 B. Fiber Installation = 7 1. Installation의 정의 = 7 2. Fiber Installation의 발생 배경 = 8 3. Fiber Installation의 설치 양식 = 11 C. Fiber Installation의 조형적 특성 = 14 Ⅲ. 작품제작 및 분석 = 26 A. 작품제작 = 26 Ⅳ. 결론 = 37 참고문헌 = 39 ABSTRACT = 4

Structural Analysis of Sur2391-582 and Discovery of a New ESX-Binding Core of Sur2, Sur2384-521

HER2 is overexpressed in metastatic breast cancer and various types of cancer. HER2 is a biomarker indicating poor prognosis and high rate of recurrence. Various types of drugs targeting HER for cancer treatment have been developed. However, problematic side effects and resistances remain yet to be solved. For the most effective therapy of HER2 positive cancer, it is necessary to discover a new drug with a novel mechanism. In previous studies, it has been reported that ESX-Sur2 interaction is critical in HER2 expression. Moreover, the soluble structure of ESX in binding interface was identified and binding core of Sur2 has also been determined. However, 3D structure of Sur2 in binding interface is still unknown. To discover small molecule inhibitors against ESX-Sur2 binding, it is necessary to understand the structure of Sur2. Therefore, in this study, we experimented in various approaches for identification of Sur2 structure. As a result of NMR data analysis, a few peaks of amino acids in Sur2 construct disappeared and peaks of the spectrum were not separated well. For these reasons, we decided to design a new construct of Sur2. Using secondary structural prediction of Sur2, three kinds of Sur2 constructs were expressed. The construct with the highest expression level was selected. The construct was expressed and purified, and then tested for ESX binding. Also, we determined the buffer condition in which the protein stably maintained its structure. Under the determined conditions, NMR experiments were proceeded. Furthermore, various compounds were screened to test the possibility to be developed as an inhibitor against ESX-Sur2 interaction. As a result, a few compounds among them were expected to inhibit ESX-Sur2 binding. To summarize, in this study, the minimal binding core of Sur2 was re-established. It is expected that, using the results, development of inhibitors against ESX-Sur2 interaction will be accelerated.;HER2는 전이성 유방암을 비롯한 여러 종류의 암에서 과발현 되고, 좋지 못한 예후와 재발 가능성을 시사하는 생체 지표이다. 현재 HER2를 타깃으로 하는 다양한 종류의 약물이 개발되어 있으나, 각 약물의 부작용과 내성 발현은 아직 해결해야 할 과제로 남겨져 있다. 보다 효율적인 HER2 양성 암에 대한 치료를 위하여 HER2를 타깃으로 하는 새로운 기전의 약물 개발이 시급한 실정이다. 이전에 발표된 연구에서 ESX와 Sur2의 상호작용은 HER2의 발현에 있어서 매우 중요한 역할을 담당한다는 것이 알려져 있다. 이와 더불어 ESX 단백질 상에 존재하는 Sur2 결합 부위의 3차원적인 구조가 밝혀져 있으며 ESX와 결합에 참여하는 Sur2의 부위도 알려져 있다. 그러나 Sur2 단백질 상의 ESX 결합부위의 3차원적인 구조는 아직 밝혀지지 못하였다. ESX와 Sur2의 결합을 억제하는 저분자 의약품 개발을 위해서는 ESX의 구조뿐 아니라 Sur2의 구조에 대한 이해가 반드시 필요하므로 본 연구에서는 Sur2의 ESX 결합부위의 구조를 밝히기 위한 실험들을 진행하였다. 보고된 Sur2의 ESX 결합부위는 NMR 실험을 통한 구조 분석을 수행하기에 적합하지 못한 크기이므로 이전까지 진행된 연구에서 결합에 참여하는 더 작은 핵심 부위를 밝혔고 본 연구에서는 이를 이용하여 NMR 실험을 진행하였다. NMR 실험 결과를 통하여 Sur2 단백질의 아미노산 서열에 따른 피크 배정을 수행하였다. NMR 데이터를 분석한 결과, Sur2 단백질의 각 아미노산 잔기에 해당하는 피크가 모두 나타나지 않았고 퍼짐성도 충분히 좋지 못하여 구조를 분석하기에 적합하지 않다고 판단되었다. 이러한 이유로 새로운 Sur2 단백질의 설계가 필요하였다. Sur2 단백질의 2차 구조 예측을 통하여 세 가지 종류의 Sur2 구성을 선택하여 발현시킴으로써 가장 발현율이 높은 한 가지 Sur2 구성을 채택하였고 이를 발현, 정제하여 ESX와의 결합을 조사하고 상대적으로 안정한 상태를 유지할 수 있는 완충 용액 조건을 확립하였다. 확립된 조건 하에서 NMR 실험을 진행하였다. 또한, 여러 화합물의 ESX-Sur2 상호작용 억제제로 개발 가능성을 조사하였고 이들 중 농도 의존적으로 ESX-Sur2 결합을 억제할 것으로 기대되는 화합물을 찾았다. 본 연구를 통하여 ESX에 결합하는 Sur2의 최소 핵심 부위를 재확립할 수 있었고 실험 결과들을 토대로 ESX-Sur2 결합 억제제 개발을 가속화시킬 수 있을 것으로 기대된다.I. Introduction 1 II. Materials and Methods 7 A. Materials 7 B. Methods 7 1. Secondary structural prediction & subcloning 7 2. Protein expression & purification 8 3. Buffer stability test 12 4. Dynamic light scattering (DLS) 12 5. Cell culture 13 6. Transient transfection & SEAP reporter gene assay 13 7. NMR spectroscopy 16 a. Heteronuclear single-quantum correlation (HSQC) spectroscopy 16 b. Triple resonance experiments and sequential assignments 17 III. Results 20 A. Experiments using Sur2391-582 construct 20 1. Expression of His- Sur2391-582 20 2. Size exclusion chromatography 22 3. Sequential backbone assignments of Sur2391-582 24 B. Experiments using Sur2384-521 construct 27 1. Secondary structural predictin of Sur2 27 2. Expression of Sur2 constructs 29 3. Binding between Sur2391-582 and ESX 31 4. Buffer test of Sur2384-521 33 5. HSQC of Sur2384-521 35 C. Search for potent small molecular inhibitor against Sur2-ESX interaction 37 IV. Discussion 40 References 44 국문초록 5