Regulation of IL-24 by Tannerella forsythia in oral keratinocytes

학위논문 (석사)-- 서울대학교 대학원 : 치의학대학원 치의과학과, 2019. 2. 최봉규.1. 목 적 인터루킨 -24 (IL-24)는 인터루킨 -10 계열의 구성원으로 IL-24 수용체 (IL-20R2 / IL-20R1 및 IL-20R2 / IL-22R1)와 결합한다. 동일한 수용체를 공유하는 사이토카인인 IL-19 및 IL-20과 달리, IL-24는 당화되어서 생물학적 활성을 가질 수 있다. IL-24는 염증성 장 질환 (IBD), 건선, 류마티스 관절염 (RA) 및 각막염과 같은 염증성 질환에서 고도로 발현되었다. Tannerella forsythia는 그람 음성균이며 치주 질환의 원인균으로 알려져 있다. 이전의 프로테옴 연구에서 T. forsythia가 48 시간 감염 후 사람 구강 각화 세포 (HOK-16B 세포)에서 IL-24를 유의하게 증가시키는 것으로 나타났다. T. forsythia의 몇 가지 독성 인자와 그 경로 기전이 연구되었지만 IL-24에 대한 연구는 아직 이루어지지 않았다. 본 연구의 목적은 T. forsythia에 의한 HOK-16B 세포의 IL-24 유도와 관련된 인자들과 염증성 인자의 발현에 미치는 IL-24의 영향을 조사하는 것이다 2. 방 법 HOK-16B 세포를 T. forsythia 및 Streptococcus oralis (S. oralis)로 12 내지 48 시간 동안 다양한 MOI (0, 100, 500)에서 처리 하였다. IL-24의 mRNA 수준은 실시간 중합효소연쇄반응으로, 단백질 수준은 면역블로팅으로 분석하였다. IL-24 생산에 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS)이 관련되는지 알아보기 위해 T. forsythia의 ROS 생성을 2',7'- 디클로로플루오레신 디아세테이트 (DCF-DA)을 사용하여 측정하 였고 ROS에 의한 IL-24 발현 및 당화 조절은 ROS 억제제인 N-아세틸시스테인 (NAC)을 사용하여 평가하였다. 사이토카인 및 MAPK 신호 전달 경로에 의한 IL-24의 조절을 분석하기 위해 염증성 사이토 카인인 IL-6 및 TNF-α와 MAPK 억제제를 HOK-16B 세포에 처리한 후 IL-24의 발현을 실시간 중합효소연쇄반응 및 면역 블로팅으로 분석하였다. IL-24가 염증 유발 인자를 유도 할 수 있는지 알아보기 위해 HOK-16B 세포를 재조합 IL-24로 처리하여 IL-1α, IL-8, CXCL10 및 MCP-1의 발현을 실시간 중합효소연쇄반응으로 분석하였다. 3. 연구결과 T. forsythia는 HOK-16B 세포에서 IL-24 발현을 유도하고 배양 상등액으로 당화된 IL-24를 분비하였으나 S. oralis에 의해서는 이러한 현상이 일어나지 않았다. T. forsythia는 HOK-16B 세포에서 ERK 및 p38을 활성화 시켰으며, 이들의 활성화를 억제했을 때 IL-24의 발현 감소 및 당화된 IL-24의 분비가 감소했다. T. forsythia는 HOK-16B 세포에서 ROS 생성과 IL-6 발현을 증가시켰다. IL-6는 IL-24 발현 및 당화의 강력한 유도제였다. IL-24의 발현과 당화는 ROS 억제제인 NAC와, ERK와 p38의 억제제를 처리했을 때 감소하였다. 재조합 단백질 IL-24를 HOK-16B 세포에 처리했을 때 IL-1α, IL-8, CXCL10 및 MCP-1의 발현이 유의하게 증가한 반면 IL-6 발현에는 영향을 주지 않았다. 4. 결 론 당화된 IL-24는 HOK-16B 세포에서 T. forsythia에 의해 유도되었으며 ROS와 MAPK 활성화를 통해 유도된 IL-6에 의해 조절되었다. IL-24는 전염증성 인자를 증가시켰으며 이 결과는 T. forsythia에 의해 유도 된 IL-24가 치주 병인과 관련이 있음을 시사한다.Objectives Interleukin-24 (IL-24) is a member of the interleukin-10 family and binds to the IL-24 receptors (IL-20R2/IL-20R1 and IL-20R2/IL-22R1). Unlike IL-19 and IL-20, which are cytokines that share the same receptors, IL-24 can be glycosylated to be biologically active. IL-24 was highly expressed in inflammatory diseases such as inflammatory bowel disease (IBD), psoriasis, rheumatoid arthritis (RA) and keratitis. Tannerella forsythia is a gram-negative bacteria and is known to be a causative agent of periodontal disease. Our preliminary proteomic study showed that T. forsythia significantly increased IL-24 in human oral keratinocytes (HOK-16B cells) after 48 h incubation. Several virulence factors and their pathogenic mechanisms of T. forsythia have been studied, but no studies have been conducted on IL-24. The objective of this study was to examine the factors involved in the induction of IL-24 in HOK-16B cells by T. forsythia and the effect of IL-24 on the expression of pro-inflammatory factors. Methods HOK-16B cells were treated with T. forsythia and Streptococcus oralis (S. oralis) at various MOIs (0, 100, 500) for 12 to 48 hr. The mRNA level of IL-24 was measured by real-time RT-PCR and the protein level was measured by immunoblotting. To determine whether reactive oxygen species (ROS) was associated with IL-24 production, ROS generation by T. forsythia was measured using 2,7-dichlorofluorescin diacetate (DCF-DA) and the regulation of IL-24 expression and glycosylation by ROS were evaluated by using a ROS inhibitor N-acetylcysteine (NAC). To analyze the regulation of IL-24 by cytokines and MAPKs signaling pathway, IL-6 and TNF-α, which are inflammatory cytokines, and MAPKs inhibitors were added into HOK-16B cells and the expression of IL-24 was analyzed by real-time RT-PCR and immunoblotting. To assess whether IL-24 can induce pro-inflammatory factors, HOK-16B cells were treated with recombinant IL-24 and the expression of IL-1α, IL-8, CXCL10, and MCP-1 was analyzed by real-time RT-PCR. Results T. forsythia induced the expression of IL-24 in HOK-16B cells and secretion of glycosylated IL-24 into the culture supernatants, but S. oralis did not. T. forsythia activated ERK and p38 in HOK-16B cells and inhibition of ERK and p38 activation resulted in reduced expression of IL-24 and secretion of glycosylated IL-24. T. forsythia increased the level of ROS and IL-6 expression in HOK-16B cells. IL-6 was a strong inducer of IL-24 expression and glycosylation. IL-24 expression and glycosylation were decreased when treated with NAC, an ROS inhibitor, and inhibitors of p38 and ERK. Recombinant IL-24 induced IL-1α, IL-8, CXCL10, and MCP-1 in HOK-16B cells, but not IL-6. Conclusion In this study, glycosylated IL-24 was induced by T. forsythia in HOK-16B cells and it was regulated by IL-6 via ROS and MAPK activation. IL-24 was able to increase pro-inflammatory factors. These results indicate that T. forsythia-induced IL-24 may be involved in periodontal pathogenesis.Abstract 2 Ⅰ. Introduction 9 Ⅱ. Materials and Methods 14 2.1. Bacteria culture and growth condition 14 2.2. Cell culture 14 2.3. Real-time reverse transcription polymerase chain reaction (real-time RT-PCR) 15 2.4. Agarose gel electrophoresis of PCR products 18 2.5. Immunoblotting 18 2.6. Enzyme-linked immuonsorbent assay (ELISA) 20 2.7. PNGase F treatment 21 2.8. Pro-inflammatory cytokine treatment 21 2.9. ROS fluorescence measurement 22 2.10. Inhibitor treatment 22 2.10.1. NAC treatment 22 2.10.2 MAPK inhibitor treatment 23 2.11. Statistical analysis 23 Ⅲ. Results 24 3.1. Expression of IL-24 and IL-24 receptors in HOK-16B cells and HGFs by T. forsythia 24 3.2. De-glycosylation of secreted IL-24 by N-glycosidase f 30 3.3 Expression of IL-20 cytokines and SOCS3 32 3.4 IL-24 regulation by IL-6 34 3.5. IL-24 regulation by ROS 40 3.6. IL-24 regulation by MAPKs 43 3.7. IL-6 regulation by ROS and MAPKs 47 3.8. Effect of recombinant IL-24 on pro-inflammatory factors 52 Ⅳ. Discussion 54 Ⅴ. References 57 국문초록 63Maste