Construction of Combind-RNAi Element Targeting to Conserved Regions of HIV-1 and Cell Receptor Gene

RNA干扰技术(RNAi)是HIV-1治疗研究方面已展示出具有很好的应用潜力。然而，由于HIV-1病毒的高突变率，其在RNAi靶点序列的碱基突变可显著降低或解除RNAi介导的抑制效果。因此有效的抗病毒突变策略是目前RNAi技术抗HIV-1研究的重点。多靶点抑制策略有望降低病毒逃逸突变对RNAi治疗措施的影响，本研究即探讨构建可高效靶向HIV-1与HIV-1细胞受体蛋白的多靶点RNAi元件。 本实验室在之前的研究中，设计了165个靶向HIV-1基因组不同保守区域的siRNA，通过筛选获得了一批能够高效抑制HIV-1的RNAi靶点，包括siRNA-vif37、siRNA-pol1102以及siR...RNA interference (RNAi) is a powerful approach to inhibit human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) replication. However, HIV-1 can escape from RNAi-mediated antiviral therapy by selection of mutations in the targeted sequence. Simultaneous targeting of multiple highly conserved viral sequences has been suggested for a promise to avoid viral escape. In this study, we tested a multiple miRNA expr...学位：理学硕士院系专业：生命科学学院生物学系_生物化学与分子生物学学号：2172006115225

靶向HIV-1 vif的高效人工miRNA的构建及慢病毒介导的体外抗病毒研究

RNAi在HIV-1的治疗研究中得到了广泛的应用,构建高效并且安全的RNAi抗病毒元件是开展相关研究的基础。vif37是以前的研究中筛选获得的靶向HIV-1 vif的高抑制效率兼具保守性的RNAi靶点。miRNA在抑制效率和启动子的选择上比常用的shRNA具有优势。本研究探索以人工miRNA结构引发vif37靶点对应的RNAi。本研究以天然的miR-155前体为骨架,采用步移的方式设计了3个靶向vif37的人工miRNA,以RNA聚合酶Ⅱ类启动子指导表达。miRNA表达质粒和HIV-1的感染性克隆pNL4-3共转染的结果显示,3个人工miR-NA中只有miR-vif37H具有抑制效果,效率与shRNA-vif37相当。与携带靶序列的荧光素酶报告质粒共转染实验证明miR-vif37H具有良好的抑制特异性。用表达miR-vif37H的重组慢病毒转导HIV-1的敏感细胞MT-4,克隆化后获得稳定表达miR-vif37H的细胞株MT-4-miR37H,该细胞可以有效抑制HIV-1的体外复制。实时RT-PCR检测结果显示,与shRNA-vif37相比,miR-vif37H的表达水平明显下降,安全性更好。进一步的实时RT-PCR检测结果还显示,miR-vif37H在细胞内的稳定表达不会影响内源代表性miRNA(miR-181和miR-16)的加工以及干扰素应答相关基因Stat1的mRNA水平。miR-vif37H是一个特异的高效RNAi元件,为vif37靶点的进一步应用研究奠定了基础

MiR-127-3p靶向MAPK4对葡萄膜黑色素瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

【目的】探讨miR-127-3p对葡萄膜黑色素瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的作用。【方法】通过RT-qPCR检测人葡萄膜黑色素瘤组织及细胞、正常组织及细胞中miR-127-3p与MAPK4mRNA的表达；通过Lipofectamine2000说明书将mimic-NC、miR-127-3pmimic、pc-MAPK4质粒分别或联合转染进入SP6.5或OM431细胞；通过双荧光素酶报告检测miR-127-3p与MAPK4复染靶向关系；通过CCK-8法检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡，划痕实验检测细胞迁移能力，Transwell法检测细胞侵袭能力，蛋白印迹法检测AKT/mTOR通路蛋白相对表达水平。【结果】在葡萄膜黑色素瘤组织和细胞系中，miR-127-3p表达明显下调（P<0.01），而MAPK4表达明显上调（P<0.01）；miR-127-3p与MAPK43′UTR区存在结合位点，miR-127-3p高表达明显抑制了含有野生型MAPK4质粒的荧光素酶活性（P<0.01），但对突变型MAPK4质粒的荧光素酶活性无影响；与Control组相比，miR-127-3pmimic组SP6.5细胞和OM431细胞增殖均明显下降（P<0.01），凋亡率均明显增加（P<0.01），划痕闭合率均明显降低（P<0.01），每视野侵袭细胞数目均明显减少（P<0.01），p-AKT（T308）/AKT、p-mTORr（S473）/mTOR蛋白表达均明显下调（P<0.01），共转染pc-MAPK4逆转上述变化。【结论】MiR-127-3p通过靶向下调MAPK4来抑制葡萄膜黑色素瘤细胞增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡，这可能与抑制AKT/mTOR通路激活有关

重组慢病毒对不同哺乳动物细胞基因转移及表达效率的研究

慢病毒是一种具有独特优点和巨大应用潜力的哺乳动物细胞基因转移载体,我们对慢病毒载体对不同哺乳动物细胞的基因转移及表达效率进行了平行比较研究.应用第三代重组慢病毒系统构建了携带CMV启动子-EGFP报告基因表达元件的重组慢病毒Lenti-EGFP,分别对多种不同哺乳动物细胞进行转导实验,在转导48 h后应用流式细胞仪检测报告基因在不同细胞株中的转移及表达效率.我们共使用了29种哺乳动物细胞株,包括14种人类组织细胞,5种猴组织细胞,9种鼠组织细胞,1种兔组织细胞.结果显示,重组慢病毒具有良好的基因转移能力,可有效进入多数哺乳动物细胞,对不同种属来源的细胞没有表现出特别的偏嗜性,但对贴壁培养细胞的基因转移效率明显高于对悬浮培养细胞.本研究为重组慢病毒系统的合理使用提供了基础

靶向HIV-1pol的高效人工miRNA的构建与体外抗病毒能力评价

RNAi技术在抗HIV-1治疗研究中已显示出巨大潜力,获得可高效特异抑制HIV-1的RNAi元件是进行相关研究的重要基础。miRNA在抑制和表达方式上相比siRNA具有更多的优势。本研究即探讨构建可高效特异靶向HIV-1的人工miRNA元件。选择以保守性较好的HIV-1pol基因为靶区筛选高效保守的RNAi序列,设计了16个可靶向pol区高保守区段的RNAi靶点,构建表达载体与HIV-1感染性克隆进行共转染抑制实验,筛选显示pol1026序列兼具高保守性及高抑制效率特点。以天然miR-30a为基础骨架构建了靶向pol1026靶点的人工miRNA元件,通过与HIV-1感染性克隆质粒的共转染抑制实验验证获得了可有效抑制HIV-1表达的人工miRNA元件(miR-1026E)。通过与携带靶序列的报告质粒的共转染实验证明miR-1026E具有良好的靶点特异性。本研究进一步构建了携带miR-1026E表达元件的重组慢病毒,转导MT-4细胞并对转导后细胞进行克隆化筛选,获得稳定整合miR-1026E表达元件的MT-4-miR1026E细胞克隆,该细胞在体外攻毒实验中可高效抑制HIV-1的复制,具有显著的抑制HIV-1的能力。同时应用实时RT-PCR方法检测显示,miR-1026E在细胞中不会影响内源性代表miRNA(miR-181与miR-16)的表达水平和干扰素效应相关基因stat1的表达水平,具有良好的特异性。所获得的可特异高效抑制HIV-1复制的人工miRNA元件可为抗HIV-1研究提供重要参考

靶向HIV-1细胞受体基因CCR5的人工miRNA的构建与鉴定

趋化因子CCR5是HIV-1入侵机体细胞的主要辅助受体之一,通过抑制CCR5的表达可以在一定程度上阻断HIV-1的复制进程.miRNA介导的RNA干扰相比经典的siRNA在应用中具有更多的特点.本研究的目的是构建可特异有效靶向CCR5的人工miRNA元件.本研究以CCR5基因序列为模板设计了14个miRNA靶序列,以天然miR-30a为基础骨架通过靶序列区替换构建人工miRNA元件.通过将miRNA表达质粒与携带靶序列区的报告质粒的共转染抑制实验检测不同miRNA的抑制效率,结果显示miCCR-13A具有较好的抑制效率和特异性.进一步将miCCR-13A表达载体转染CCR5阳性的HIV-1受体细胞株TZM-b1,RT-PCR检测显示miCCR-13A可在细胞中获得有效表达,同时应用免疫流式细胞术检测显示在miCCR-13A转染细胞相比对照细胞的CCR5蛋白的检测活性明显降低.进一步的研究显示miCCR-13A在细胞中不会影响细胞活性和干扰素效应相关基因osa1和stat1 mRNA水平,具有良好的特异性.本研究获得的可特异靶向CCR5的人工miRNA元件可为进一步的抗HIV-1研究提供重要基础

靶向HIV-1 vif的高效siRNA的筛选及慢病毒介导的体外抗病毒研究

RNAi技术在艾滋病治疗研究中已展现出巨大的潜力,兼具高效抑制特性和保守性的siRNA靶位是其获得成功应用的重要基础。本研究选择以HIV-1 vif基因为靶区筛选高效保守的RNAi序列,共选择设计了30个识别不同位点的siRNA序列,以pSUPER为载体构建了相应的shRNA表达质粒。通过与pNL4-3质粒在293FT细胞中进行共转染抑制实验,以及对初筛获得的高效序列进行保守性分析显示siRNA-vif37序列具有高效抑制效率和较好的保守性特征。通过与pGL3-vif报告质粒的共转染实验证明siRNA-vif37具有vif基因抑制特异性。带有shRNA-vif37表达元件的重组慢病毒转导后的MT-4细胞在HIV-1NL4-3体外攻毒实验中可显示出较有效的抑制病毒复制的能力,本研究进一步对转导后细胞进行克隆化筛选,获得稳定整合shRNA-vif37表达元件的MT-4-vif37细胞克隆,该细胞具有显著的抑制病毒复制的能力,在高攻毒剂量下仍可获得良好的抑制效果。本研究为进一步应用RNAi技术进行新型艾滋病治疗方法研究提供了重要基础

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目的 研究高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）感染相关的宫颈病变程度与抗人乳头瘤状病毒（HPV）抗体水平的相关性,探讨HPV致病的免疫学问题。方法 选取2012年1月-2013年6月在该院妇产科门诊就诊的女性中选取60例病理确诊为女性宫颈病变（CINⅠ及以上）,且宫颈脱落细胞的DNA检测为HR-HPV阳性者为研究组,根据组织学检测结果将研究组进一步分为低度病变组30例（CINⅠ）和高度病变组30例（CINⅡ或Ⅲ）。对照组为经核酸检测无HPV感染且病理诊断未见癌前病变的门诊患者60例,按年龄进一步分为低年龄组和高年龄组。低年龄组和高年龄组与低度病变组和高度病变组的年龄差异无统计学意义（P〉0.05）。分别抽取研究组及对照组外周血,检测其抗HR-HPV L1 Ig G抗体及中和抗体滴度,比较研究组与对照组抗体阳性率及抗体滴度水平的差别。结果 研究组血清中的抗HR-HPV L1 Ig G抗体阳性率及抗体滴度均高于对照组（P〈0.05）;低度病变组患者血清中的抗HR-HPV的中和抗体滴度高于相应对照组（P〈0.05）,而高度病变组的抗HR-HPV的中和抗体阳性率及抗体水平与相应对照组比较差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 宫颈病变患者血清中抗HR-HPV L1 Ig G抗体升高,说明HPV感染可引起机体的体液免疫反应。低度病变组的中和抗体水平相对较高,可能是机体产生的中和抗体阻止了病毒的进一步感染。高度病变组的Ig G抗体和中和抗体均低下,说明进入CINⅡ/Ⅲ后HPV已经逃避了免疫系统的监视。基金项目：厦门市科技局项目（3502220124050）;2011年福建省科技计划项目资助计划,青年创新项目（20111）00310517

第十八届美国理论与应用力学大会总结

1会议概况2018年6月5—9日,第18届美国理论与应用力学大会(18th U.S. National Congress of Theoretical and Applied Mechanics, USNCTAM2018)在美国芝加哥召开.本次大会由美国力学国家委员会和中国力学学会联合主办,旨在探讨和交流近四年世界范围内在理论和应用力学领域的基础研究、创新技术的最新进展,吸引了来自世界各地的近千名专家学