Structure and function analysis of a cell shape determining glycoprotein in Streptococcaceae

轉糖鏈球菌(Streptococcus mutans)是口腔中常見的細菌，也是造成齲齒的主 要致病菌之一。在大腸桿菌研究得知細胞壁合成相關的基因如(pbpA、rodA) 和細菌的形狀有關。但有些蛋白如(Mre B、C、D)雖然和細胞壁合成無關， 但也是決定細菌形狀的重要因子。本實驗室之前發現轉糖鏈球菌中有一具 免疫優勢(immunodominant)的抗原，大小約60kDa 的 IDG-60 蛋白與決定 轉堂鏈球菌的形狀有關且其基因位置緊接在Mre D 的3’端。此外文獻報告 顯示IDG-60 也可能是醣結合蛋白(glucan binding prtein)，為了區分IDG-60 是醣蛋白或醣結合蛋白，我們從基因以及化學觀點分析。藉由PCR 方式構 築含有His-tag 的IDG-60 全長及部分片段重組蛋白的表達系統，送入轉糖 鏈球菌中表達後，純化蛋白，再利用periodic acid 來氧化糖蛋白上糖結構的 部分以及利用單一的lectin 做lectin-binding 的分析。綜合以上實驗數據我 們推論IDG-60 可能是醣結合蛋白，且醣結合位置可能在蛋白的N 端。Streptococcus mutans is the main causive agent of caries in oral cavity. Cell wall synthesis related genes, such as pbpA and rodA were closely related with cell shape determination in E. coli. However, some cell wall synthesis unrelated gene (Mre B, MreC, MreD) are also important cell shape determinant. Previously, we have identified a immunodominant and cell wall-associated protein from S. mutans and molecular weight around 60kDa. Lectin-binding assay suggested it is a glycosylated protein (named immunodominant glycoprotein 60, IDG-60). IDG-60 is also required for maintaining the integrity of the S. mutans cell wall and cell shape. Morever, the IDG60 is genetically linked with MreC and MreD, just the way found in MreB/C/D loci. At the same time, a glucan binding protein B (Gbp-B) was reported and both DNA sequences were the same. Lectin assay showed that IDG-60 might have glycosylation which must have enough grounds. So, we use different approaches, such as genetic and chemical means to exclude a mere association of the glycan moiety with protein. In this study, we have constructed the His-tagged expression system for the IDG-60 and its truncated derivatives (IDG-60 IT, IDG-60 LN, and IDG-60C). After expression in S. mutans, secreted proteins in culture supernatants were purified by affinity chromatography. Single lectin-binding, periodic acid oxidation and enzymatic assay show that IDG-60 should be glucan-binding protein. In addition, the glucan-binding domain may be located on N-terminal

決定鏈球菌形狀之一醣蛋白的結構與功能分析(2/3)

轉糖鏈球菌(Streptococcus mutans)是口腔中常見的細菌，也是造成齲齒的主 要病原菌之一。在大腸桿菌研究得知細胞壁合成相關的基因如(pbpA、rodA)和細 菌的形狀有關。但有些蛋白如(Mre B、C、D)雖然和細胞壁合成無關，但也是決 定細菌形狀的重要因子。本實驗室之前發現轉糖鏈球菌中有一具免疫優勢 (immunodominant)的抗原，大小約60kDa 的 IDG-60 蛋白與決定轉糖鏈球菌的形 狀有關且其基因位置緊接在Mre D 的3’端。此外文獻報告顯示IDG-60 也可能是 醣結合蛋白(glucan binding prtein)，為了區分IDG-60 是醣蛋白或醣結合蛋白，我 們從基因以及化學觀點分析。藉由PCR 方式構築含有His-tag 的IDG-60 全長及 部分片段重組蛋白的表達系統，送入轉糖鏈球菌中表達後，純化蛋白，再利用 periodic acid 來氧化糖蛋白上糖結構的部分以及利用單一的lectin 做lectin-binding 的分析，並且利用單醣分析含His-tag 的IDG-60 全長及部分片段重組的蛋白。另 外我們利用轉糖鏈球菌的基因庫找出所有與糖代謝相關的基因，將產生 UDP-galactose 和UDP-glucose 酵素的基因galT 和galE 重組，並送入轉糖鏈球菌 中互換，使其失去正常的功能，再利用western blot 和lectin-binding 的分析，觀 察對於IDG-60 蛋白是否有影響。綜合以上實驗數據我們推論IDG-60 可能是醣 蛋白， 且可能的糖化結構有galactose 以β (1- 4) 的方式鍵結到 N-acetylglucosesamine 或是sialic acid 以α(2-3)的方式與galactose 鍵結