代谢工程在生物脱硫中的应用

生物脱硫具有选择性高﹑反应条件温和等优点，是实现石油及其产品深度脱硫最有效的技术之一。生物脱硫要走向工业化应用必须提高已有脱硫微生物的催化活性。本论文工作针对本实验室分离的专一性脱硫微生物红平红球菌Rhodococcus erythropolis LSSE8-1，利用代谢工程的手段提高其脱硫活性。 对专一性脱硫微生物脱硫相关基因的保守性进行了研究。根据R. erythropolis IGTS8 脱硫基因的保守区设计引物，PCR 扩增得到了Bacillus brevis R-6和Pseudomonas delafleldii R-8 的脱硫相关基因。测序结果表明与IGTS8 的相关脱硫基因相似性在99 %以上。以上结果表明专一性脱硫菌株脱硫基因高度保守。 在大肠杆菌中高效表达出了有活性的脱硫基因的重组蛋白，研究了单个脱硫相关基因的功能。分别构建了脱硫相关基因的表达质粒pET-21a-dszA、pET-28a-dszB和pET-28a-dszC。转化E. coli BL21(DE3)。经过IPTG诱导表达后的全细胞蛋白SDS-PAGE结果表明dzsA、dszB和dszC得到了高效表达。通过对三株重组菌的无细胞粗提液代谢产物的HPLC检测，证实了表达出来的融合蛋白具有一定的催化活性。 通过提高脱硫相关基因的拷贝数和加强氧化还原酶基因dszD的表达，得到了脱硫活性提高的重组菌Rhodococcus sp. LSSE8-2和LSSE8-3和LSSE8-4。Rhodococcus sp. LSSE8-4是携带有dszD的表达质粒的重组菌。当以二苯并噻吩（DBT）为硫源时，重组菌株Rhodococcus sp. LSSE8-2和LSSE8-3的脱硫活性差别不大，都高于原始菌LSSE8-1；但是当以硫酸盐为硫源时，Rhodococcus sp. LSSE8-2的脱硫活性大大降低而LSSE8-3的脱硫速率仍然维持在一定水平。Rhodococcus sp. LSSE8-4在脱硫后期才表现出较高的2-羟基联苯（2-HBP）生成速率。在脱硫反应的终点，Rhodococcus sp. LSSE8-4的2-HBP生成量为1.54 mM，高于原始菌的1.3 mM。对于起始硫含量为497 mg L-1的柴油，经过4 h重组菌Rhodococcus sp. LSSE8-3 能将柴油中的大约82%的硫脱除，而原始菌只能脱除其中61%的硫。 利用vgb在R. erythropolis LSSE8-1异源表达，得到了生长状况和脱硫活性都得到改善的重组菌株。重组菌的CO差光谱在419nm处有特征峰出现，表明vgb在脱硫菌中得到了有效的表达。重组菌和原始菌相比，相同培养条件下可以获得更大的生长量，在培养的后期，OD600达到12.6，而原始菌为10.4。在DBT模拟油相脱硫实验中，重组菌在正常条件和低溶氧条件下均表现出较高的脱硫活性。在实际柴油的脱硫过程中，重组菌能脱除硫含量为261.3mg L-1柴油中73%的硫，而在相同条件下原始菌Rhodococcus sp. LSSE8-1脱硫率为62%。 在Rhodococcus sp. LSSE8-1中引入功能已知的、来源于芳香族化合物降解菌株Rhodococcus sp. RHA1的双组分信号转导系统BphS/BphT，得到了脱硫基因的表达受脱硫终产物2-HBP诱导的重组菌株LSSEB-5。为了更加合理地设计实验，建立了脱硫基因的表达受BphS/BphT表达的数学模型。通过对Rhodococcus sp. LSSEB-5的报告基因绿色荧光蛋白GFP的荧光强度的测定，定量地研究了这种产物诱导型的基因回路中基因表达的动力学行为。与增加了脱硫基因拷贝数的重组菌Rhodococcus sp. LSSE8-2相比，LSSEB-5表现出更高的脱硫活性。 本论文工作不仅得到了多株脱硫活性得到提高的R. erythropolis LSSE8-1重组菌，而且对于将来进一步利用基因工程的手段改造脱硫微生物和构建新型表达载体也具有借鉴作用

红平红球菌LSSE8-1中辅因子再生系统的构建

采用PCR方法从红球菌Rhodococcus sp．RHA1基因组中克隆了编码甲酸脱氢酶的基因（fdh），将该基因片段插入大肠杆菌-红球菌穿梭质粒pBS306，构建了甲酸脱氢酶表达质粒pBS-PFG，转入专一性脱硫菌R．erythropolis LSSE8-1，得到重组菌LSSE8-1-FDH、2,3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）显色反应测得重组菌LSSE8-1-FDH的总脱氢酶活（OD4％）为0．464，原始菌LSSE8-1的总脱氢酶活（OD496）为0．353，重组菌比原始菌酶活增加了31％．考察了不同浓度甲酸根对R．erythropolis LSSE8-1与重组菌LSSE8-1-FDH生长的影响，当甲酸根浓度为25mmol／L时重组菌LSSE8-1-FDH的生长最佳．油水相静息细胞脱硫实验表明，重组LSSE8-1-FDH菌比宿主菌的脱硫速率增加了12．5％，煎胼碲塞增加了约20

红平红球菌lsse81中辅因子再生系统的构建

采用PCR方法从红球菌Rhodococcus sp．RHA1基因组中克隆了编码甲酸脱氢酶的基因（fdh），将该基因片段插入大肠杆菌-红球菌穿梭质粒pBS306，构建了甲酸脱氢酶表达质粒pBS-PFG，转入专一性脱硫菌R．erythropolis LSSE8-1，得到重组菌LSSE8-1-FDH、2,3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）显色反应测得重组菌LSSE8-1-FDH的总脱氢酶活（OD4％）为0．464，原始菌LSSE8-1的总脱氢酶活（OD496）为0．353，重组菌比原始菌酶活增加了31％．考察了不同浓度甲酸根对R．erythropolis LSSE8-1与重组菌LSSE8-1-FDH生长的影响，当甲酸根浓度为25mmol／L时重组菌LSSE8-1-FDH的生长最佳．油水相静息细胞脱硫实验表明，重组LSSE8-1-FDH菌比宿主菌的脱硫速率增加了12．5％，煎胼碲塞增加了约20

专一性脱硫菌脱硫活性比较与基因保守性研究

对几株能专一性脱除二苯并噻吩（DBT）中硫元素生成2-羟基联苯的细菌,即短芽孢杆菌（Bacillus brevis）R-6、德氏假单孢菌（Pseudomonas delafleldii）R-8、小球诺卡氏菌（Nocardia globerula）R-9、球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericus）R-16、红平红球菌（Rhodococcus erythropolis）LSSE8-1和戈登氏菌（Gordonia nitida）LSSEJ-1展开研究.对照研究发现它们对DBT及其衍生物的代谢活性存在着一定的差异.为了从基因水平分析造成这些差别的原因,对这几株菌的脱硫基因展开了研究.根据Rhodococcus erythropolis IGTS8脱硫基因的保守区设计引物,PCR扩增了R-6、R-8的脱硫基因.测序结果表明脱硫基因高度保守,与IGTS8的相关脱硫基因相似性在99%以上.为了进一步验证不同专一性脱硫菌的脱硫基因的保守性,PCR扩增、克隆了LSSEJ-1和R-9的整个脱硫操纵子,结果表明脱硫基因在这两株菌中也是高度保守的.与IGTS8的相关脱硫基因相比较：R-9的dszA与IGTS8的dszA同源性为99.6%,LSSEJ-1的dszA与IGTS8的dszA的同源性为99.9%;R-9和LSSEJ-1的dszB的同源性与IGTS8的dszB都是99.9%;R-9的dszC与IGTS8的dszC同源性是99.9%,LSSEJ-1的dszC与IGTS8的dszC同源性为99.1%.对比研究认为专一性脱硫嗜温菌的脱硫基因的起源可能相同

专一性脱硫菌脱硫活性比较与基因保守性研究

对几株能专一性脱除二苯并噻吩(DBT)中硫元素生成2-羟基联苯的细菌,即短芽孢杆菌(Bacillus brevis)R-6、德氏假单孢菌(Pseudomonas delafleldii)R-8、小球诺卡氏菌(Nocardia globerula)R-9、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)R-16、红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)LSSE8-1和戈登氏菌(Gordonia nitida)LSSEJ-1展开研究。对照研究发现它们对DBT及其衍生物的代谢活性存在着一定的差异。为了从基因水平分析造成这些差别的原因,对这几株菌的脱硫基因展开了研究。根据Rhodococcus erythropolisIGTS8脱硫基因的保守区设计引物,PCR扩增了R-6、R-8的脱硫基因。测序结果表明脱硫基因高度保守,与IGTS8的相关脱硫基因相似性在99%以上。为了进一步验证不同专一性脱硫菌的脱硫基因的保守性,PCR扩增、克隆了LSSEJ-1和R-9的整个脱硫操纵子,结果表明脱硫基因在这两株菌中也是高度保守的。与IGTS8的相关脱硫基因相比较:R-9的dszA与IGTS8的dszA同源性为99.6%,LSSEJ-1的dszA与IGTS8的dszA的同源性为99.9%;R-9和LSSEJ-1的dszB的同源性与IGTS8的dszB都是99.9%;R-9的dszC与IGTS8的dszC同源性是99.9%,LSSEJ-1的dszC与IGTS8的dszC同源性为99.1%。对比研究认为专一性脱硫嗜温菌的脱硫基因的起源可能相同

脱硫菌Rhodococcus sp.LY822专一性脱硫活性及相关基因的研究

以专一性脱硫菌Rhodococcus sp.LY822质粒DNA为模板,利用已知的脱硫基因序列设计引物,PCR扩增得到了3个脱硫基因片段dszA,dszB和dszC.构建了相应的表达质粒pETA,pETB和pETC,在转化大肠杆菌BL21(DE3)中表达,得到了dszA,dszB和dszC基因的融合表达产物.SDS-PAGE分析结果显示,蛋白带分子量分别为50,40和45kDa.3种重组菌BL21(DE3)(pETA),BL21(DE3)(pETB)和BL21(DE3)(pETC)的无细胞粗提液(2mL)的活性检测结果表明,DszC酶的粗提液反应30min能够将0.02mmol/L二苯并噻吩完全转化为二苯并噻吩砜,DszA酶的粗提液能够将0.01mmol/L二苯并噻吩砜完全转化为羟基联苯亚磺酸盐,DszA和DszB酶的粗提液联合作用能够将0.01mmol/L二苯并噻吩砜完全转化为2-羟基联苯,证明LY822对二苯并噻吩的降解符合专一性脱硫的"4S途径"

脱硫工程菌的构建及其脱硫性能分析

以专一性脱硫菌德氏假单胞菌Pseudomonas delafieldii R-8为出发菌株,利用pPR9TT穿梭质粒构建脱硫操纵子表达载体,转化原始菌培养得到1株多拷贝脱硫基因的脱硫工程菌R-8-1,并对其脱硫性能进行了研究。结果表明,在同样的生物催化脱硫反应条件下,工程菌的脱硫活性达到6.25μmol DBT/g dry cell/h,是原始菌的2倍;柴油的脱硫试验表明,在12h内工程菌静息细胞能将柴油硫含量从310.8mg/L降至100.1mg/L,脱硫率达到68%,而原始菌为53%。进一步比较了重组质粒pPR-dsz在工程菌株中传代的稳定性,试验表明pPR-dsz在工程菌株R-8-1中具有良好的遗传稳定性。此研究为生物脱硫提供了1株优良的工程菌株,并为该技术的应用提供了参考

专一性脱硫菌脱硫活性比较与基因保守性研究

对几株能专一性脱除二苯并噻吩（DBT）中硫元素生成2-羟基联苯的细菌,即短芽孢杆菌（Bacillus brevis）R-6、德氏假单孢菌（Pseudomonas delafleldii）R-8、小球诺卡氏菌（Nocardia globerula）R-9、球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericus）R-16、红平红球菌（Rhodococcus erythropolis）LSSE8-1和戈登氏菌（Gordonia nitida）LSSEJ-1展开研究.对照研究发现它们对DBT及其衍生物的代谢活性存在着一定的差异.为了从基因水平分析造成这些差别的原因,对这几株菌的脱硫基因展开了研究.根据Rhodococcus erythropolis IGTS8脱硫基因的保守区设计引物,PCR扩增了R-6、R-8的脱硫基因.测序结果表明脱硫基因高度保守,与IGTS8的相关脱硫基因相似性在99%以上.为了进一步验证不同专一性脱硫菌的脱硫基因的保守性,PCR扩增、克隆了LSSEJ-1和R-9的整个脱硫操纵子,结果表明脱硫基因在这两株菌中也是高度保守的.与IGTS8的相关脱硫基因相比较：R-9的dszA与IGTS8的dszA同源性为99.6%,LSSEJ-1的dszA与IGTS8的dszA的同源性为99.9%;R-9和LSSEJ-1的dszB的同源性与IGTS8的dszB都是99.9%;R-9的dszC与IGTS8的dszC同源性是99.9%,LSSEJ-1的dszC与IGTS8的dszC同源性为99.1%.对比研究认为专一性脱硫嗜温菌的脱硫基因的起源可能相同

枯草芽孢杆菌联产纳豆激酶和γ-聚谷氨酸

利用实验室保存的纳豆激酶生产菌Bacillus subtilis Natto NLSSe进行了γ-聚谷氨酸合成研究,在不添加谷氨酸的培养基中合成了分子量在200～300万Da的γ-聚谷氨酸,表明该菌是谷氨酸非依赖型菌.合成纳豆激酶的合适碳、氮源分别是蔗糖和大豆蛋白胨,合成γ-聚谷氨酸的合适碳、氮源分别是柠檬酸和NH4C1.通过正交实验研究了碳、氮源对纳豆激酶和γ-聚谷氨酸联产的影响,结果表明,增加培养基中大豆蛋白胨及柠檬酸的浓度能分别促进纳豆激酶和γ-聚谷氨酸的合成,而不抑制另一产物的合成,有利于纳豆激酶和γ-聚谷氨酸的联产.在大豆蛋白胨10g/L,NH4C19g/L,柠檬酸15g/L时,纳豆激酶酶活为121.2U/mL,γ-聚谷氨酸产量为1.1g/L,均达到了单独合成时的水平