不同水生脊椎动物的血清与黏液蛋白图谱分析

因脊椎动物的血清与黏液中含有大量蛋白质及其他生物活性物质,而具有多种生理、生化与抗病防御功能。为了解水生脊椎动物血清与黏液中所含主要蛋白成分及其异同,我们分别从中华鲟(Chinese stur-geon Aclpenser sinensis grdy)、鲫鱼(Crucian carp Carassius auratus)、草鱼(Grass carp Ctenopharyngodonidellus)、赤点石斑鱼(Red-spotted grouper Epinephelus akaara)、青石斑鱼(Banded grouper Epinephelusawoara)、狗鱼(Pikes Esox reicherti)、江豚(Finless porpoise Neophocaena phocaenoides)、黄颡鱼(Yellow catfishPelteobagrus fulvidraco)、鳜鱼(Mandarin fish Siniperca chuatsi)这9种水生脊椎动物中,采集血清和皮肤黏液样本。利用考马斯亮蓝G-250法,测定了不同水生脊椎动物的血清和黏液样品中总蛋白的含量;经SDS-PAGE蛋白电泳,分别获得不同水生脊椎动物血清及黏液蛋白图谱;比较和分析了同种动物血清和黏液、不同动物之间血清与血清或黏液与黏液之间蛋白图谱的差异。结果表明:这些动物的血清蛋白组分有显著相似性,在分子量45—120 kD之间,蛋白条带大量集中分布;除青石斑鱼外,其他8种水生脊椎动物都有分子量约为28 kD和14 kD相同或相近的两条蛋白带。草鱼、鲫鱼、鳜鱼、狗鱼、黄颡鱼和江豚的黏液蛋白,除了都含有分子量大小约为45 kD的蛋白条带外,其他无显著相似性。对同种水生脊椎动物的血清与黏液蛋白比较,虽然黄颡鱼的血清与黏液中分子量相近的蛋白带最多,也仅约为38%,可见其蛋白带的种类和含量都存在显著差异

噬藻体PaV-LD主要衣壳蛋白、穿孔素和内肽酶基因的克隆及表达分析

最近阐明了水华蓝藻噬藻体PaV-LD（Planktothrix agardhii Virus isolated from Lake Donghu）的全基因组序列,这是一个含有142个ORF的双链DNA噬藻体。在此,我们对其主要衣壳蛋白基因073R,内肽酶和穿孔素基因123L-124L（PaV-LD基因组中两个相邻的ORF）进行了基因克隆与表达分析。将073R克隆后构建原核表达质粒pET-32a-073R,并用IPTG进行诱导表达,073R融合蛋白经纯化后,进行免疫小鼠制备抗体;通过Western blot检测经噬藻体感染宿主细胞后073R的表达时序,结果显示在宿主细胞裂解之初,即PaV-LD感染48h以后073R开始表达,表明073R是一个晚期基因;同时073R推导的氨基酸序列与34株噬藻（菌）体及2株藻病毒（感染真核藻的病毒）的主要衣壳蛋白的氨基酸序列进行序列比对,显示073R与无尾的藻病毒衣壳蛋白亲缘关系更近。PCR扩增内肽酶和穿孔素基因123L-124L,并构建质粒pOP123L-124L,将其转入模式藻集胞藻PCC6803细胞中,质粒pOP123L-124L与藻集胞藻PCC6803基因组发生重组,形成重组藻;测定了重组藻与野生藻的生长速率,并绘制生长曲线;制备超薄切片,进一步比较和观察重组藻与野生藻的超微结构的变化。结果显示重组藻与野生藻存在生长速率与超微形态的显著差异

噬藻体PaV-LD主要衣壳蛋白、穿孔素和内肽酶基因的克隆及表达分析

最近阐明了水华蓝藻噬藻体PaV-LD(Planktothrix agardhii Virus isolated from Lake Donghu)的全基因组序列,这是一个含有142个ORF的双链DNA噬藻体。在此,我们对其主要衣壳蛋白基因073R,内肽酶和穿孔素基因123L-124L(PaV-LD基因组中两个相邻的ORF)进行了基因克隆与表达分析。将073R克隆后构建原核表达质粒pET-32a-073R,并用IPTG进行诱导表达,073R融合蛋白经纯化后,进行免疫小鼠制备抗体;通过Western blot检测经噬藻体感染宿主细胞后073R的表达时序,结果显示在宿主细胞裂解之初,即PaV-LD感染48h以后073R开始表达,表明073R是一个晚期基因;同时073R推导的氨基酸序列与34株噬藻(菌)体及2株藻病毒(感染真核藻的病毒)的主要衣壳蛋白的氨基酸序列进行序列比对,显示073R与无尾的藻病毒衣壳蛋白亲缘关系更近。PCR扩增内肽酶和穿孔素基因123L-124L,并构建质粒pOP123L-124L,将其转入模式藻集胞藻PCC6803细胞中,质粒pOP123L-124L与藻集胞藻PCC6803基因组发生重组,形成重组藻;测定了重组藻与野生藻的生长速率,并绘制生长曲线;制备超薄切片,进一步比较和观察重组藻与野生藻的超微结构的变化。结果显示重组藻与野生藻存在生长速率与超微形态的显著差异

噬藻体PaV-LD主要衣壳蛋白、穿孔素和内肽酶基因的克隆及表达分析

最近阐明了水华蓝藻噬藻体PaV-LD（Planktothrix agardhii Virus isolated from Lake Donghu）的全基因组序列,这是一个含有142个ORF的双链DNA噬藻体。在此,我们对其主要衣壳蛋白基因073R,内肽酶和穿孔素基因123L-124L（PaV-LD基因组中两个相邻的ORF）进行了基因克隆与表达分析。将073R克隆后构建原核表达质粒pET-32a-073R,并用IPTG进行诱导表达,073R融合蛋白经纯化后,进行免疫小鼠制备抗体;通过Western blot检测经噬藻体感染宿主细胞后073R的表达时序,结果显示在宿主细胞裂解之初,即PaV-LD感染48h以后073R开始表达,表明073R是一个晚期基因;同时073R推导的氨基酸序列与34株噬藻（菌）体及2株藻病毒（感染真核藻的病毒）的主要衣壳蛋白的氨基酸序列进行序列比对,显示073R与无尾的藻病毒衣壳蛋白亲缘关系更近。PCR扩增内肽酶和穿孔素基因123L-124L,并构建质粒pOP123L-124L,将其转入模式藻集胞藻PCC6803细胞中,质粒pOP123L-124L与藻集胞藻PCC6803基因组发生重组,形成重组藻;测定了重组藻与野生藻的生长速率,并绘制生长曲线;制备超薄切片,进一步比较和观察重组藻与野生藻的超微结构的变化。结果显示重组藻与野生藻存在生长速率与超微形态的显著差异

蓝细菌病毒A-4L 在鱼腥藻(Anabaena variabilis)藻苔中形成同心圆噬斑的成因

【目的】分析蓝细菌病毒A-4L 在鱼腥藻(Anabaena sp.) PCC 7120藻苔中形成同心圆噬斑的原因,阐明 A-4L 的一个重要生物学特征,为分离、鉴定和筛选新的水华蓝藻病毒提供借鉴。【方法】用初始滴度为2. 8 × 10~(10) PFU /mL 的A-4L 悬液感染鱼腥藻,在不同时间点收集裂解液绘制一步生长曲线,获得A-4L 对鱼腥藻的潜伏期和释放量。将适量A-4L 悬液感染不同培养时间的藻苔,逐日观察和记录藻苔病变情况。培养藻苔并接种适量A-4L 悬液,分别置于完全持续光照(Light∶ Dark = 24 h∶ 0 h,L∶ D = 24 h∶ 0 h)条件;完全周期光照(L∶ D = 14 h∶ 10 h)条件;或前3 d 周期光照转后3 d 持续光照的条件下,比较不同光照条件对同心圆噬斑形成的影响。然后挑取单个噬斑进行扩大培养,纯化后,负染电镜观察A-4L 的超微形态。【结果】A-4L的潜伏期为0. 5 - 2 h,释放量约为247 IU / cell (Infectious Units)。在周期光照条件下,藻苔接种A-4L 3 - 4 d后,出现同心圆噬斑,且同心圆数量与攻毒后的天数(n)有相关性,为“n - 1”;同心圆间距约为3 mm。与周期光照条件相比,在持续光照条件下未形成同心圆噬斑。而在周期光照条件转持续光照条件下,由先周期光照时所形成的同心圆在转持续光照后逐渐消失,证实同心圆噬斑的形成依赖于周期光照。负染电镜观察显示A-4L 具有一个近似球形的头部,直径约为50 nm 以及长度约为10 nm 的尾部,形态与短尾蓝细菌病毒相似。【结论】A-4L 是一株能形成同心圆噬斑的蓝细菌病毒,并揭示其同心圆噬斑形成的关键条件是周期光照

蓝细菌病毒A-4L 在鱼腥藻(Anabaena variabilis)藻苔中形成同心圆噬斑的成因

【目的】分析蓝细菌病毒A-4L 在鱼腥藻(Anabaena sp.) PCC 7120藻苔中形成同心圆噬斑的原因,阐明 A-4L 的一个重要生物学特征,为分离、鉴定和筛选新的水华蓝藻病毒提供借鉴。【方法】用初始滴度为2. 8 × 10~(10) PFU /mL 的A-4L 悬液感染鱼腥藻,在不同时间点收集裂解液绘制一步生长曲线,获得A-4L 对鱼腥藻的潜伏期和释放量。将适量A-4L 悬液感染不同培养时间的藻苔,逐日观察和记录藻苔病变情况。培养藻苔并接种适量A-4L 悬液,分别置于完全持续光照(Light∶ Dark = 24 h∶ 0 h,L∶ D = 24 h∶ 0 h)条件;完全周期光照(L∶ D = 14 h∶ 10 h)条件;或前3 d 周期光照转后3 d 持续光照的条件下,比较不同光照条件对同心圆噬斑形成的影响。然后挑取单个噬斑进行扩大培养,纯化后,负染电镜观察A-4L 的超微形态。【结果】A-4L的潜伏期为0. 5 - 2 h,释放量约为247 IU / cell (Infectious Units)。在周期光照条件下,藻苔接种A-4L 3 - 4 d后,出现同心圆噬斑,且同心圆数量与攻毒后的天数(n)有相关性,为“n - 1”;同心圆间距约为3 mm。与周期光照条件相比,在持续光照条件下未形成同心圆噬斑。而在周期光照条件转持续光照条件下,由先周期光照时所形成的同心圆在转持续光照后逐渐消失,证实同心圆噬斑的形成依赖于周期光照。负染电镜观察显示A-4L 具有一个近似球形的头部,直径约为50 nm 以及长度约为10 nm 的尾部,形态与短尾蓝细菌病毒相似。【结论】A-4L 是一株能形成同心圆噬斑的蓝细菌病毒,并揭示其同心圆噬斑形成的关键条件是周期光照