噬藻体PaV-LD主要衣壳蛋白、穿孔素和内肽酶基因的克隆及表达分析

Abstract

最近阐明了水华蓝藻噬藻体PaV-LD（Planktothrix agardhii Virus isolated from Lake Donghu）的全基因组序列,这是一个含有142个ORF的双链DNA噬藻体。在此,我们对其主要衣壳蛋白基因073R,内肽酶和穿孔素基因123L-124L（PaV-LD基因组中两个相邻的ORF）进行了基因克隆与表达分析。将073R克隆后构建原核表达质粒pET-32a-073R,并用IPTG进行诱导表达,073R融合蛋白经纯化后,进行免疫小鼠制备抗体;通过Western blot检测经噬藻体感染宿主细胞后073R的表达时序,结果显示在宿主细胞裂解之初,即PaV-LD感染48h以后073R开始表达,表明073R是一个晚期基因;同时073R推导的氨基酸序列与34株噬藻（菌）体及2株藻病毒（感染真核藻的病毒）的主要衣壳蛋白的氨基酸序列进行序列比对,显示073R与无尾的藻病毒衣壳蛋白亲缘关系更近。PCR扩增内肽酶和穿孔素基因123L-124L,并构建质粒pOP123L-124L,将其转入模式藻集胞藻PCC6803细胞中,质粒pOP123L-124L与藻集胞藻PCC6803基因组发生重组,形成重组藻;测定了重组藻与野生藻的生长速率,并绘制生长曲线;制备超薄切片,进一步比较和观察重组藻与野生藻的超微结构的变化。结果显示重组藻与野生藻存在生长速率与超微形态的显著差异