Sumoylation of LAP1 is involved in the HDAC4-mediated repression of COX-2 transcription

CEBPB, one of the CEBP family members, is a crucial regulator of gene expression during innate immunity, inflammatory responses and adipogenesis. In this study, the EGF-induced increase of CEBPB mRNA is shown to be coincident with the decrease of COX-2 mRNA. We identified that all of the individual CEBPB isoforms, LAP1, LAP2 and LIP, attenuate EGF-induced COX-2 promoter activity. Although increased sumoylation of both LAP1 and LAP2 is observed during the lagging stage of EGF treatment, only the sumoylated LAP1, but not the sumoylated LAP2, is responsible for COX-2 gene repression. In addition, EGF treatment can regulate the nucleocytoplasmic redistribution of HDAC4 and SUMO1. We further demonstrated by loss-of- and gain-of-function approaches that HDAC4 can be a negative regulator while inactivating COX-2 transcription. The sumoylation mutant LAP1, LAP1K174A, exhibits an attenuated ability to interact with HDAC4, and increased COX-2 promoter activity. Furthermore, the in vivo DNA binding assay demonstrated that LAP1K174A and CEBPDK120A, sumoylation-defective CEBPD mutants, attenuate the binding of HDAC4 on the COX-2 promoter. In light of the above, our data suggest that the suCEBPD and suLAP1 are involved in the repression of COX-2 transcription through the recruitment of HDAC4

B. 「海洋生物の医薬資源開発-医薬を指向した海洋生物の有用物質の探索」

海洋生物はその種100万といわれ、地上における今もなお未知な世界である。本年度も、この海洋生物から、医薬資源となりうる有用な生理活性物質を発見し、構造を明らかにし、生物活性を検討することを目的として研究を行い、この研究を始めてから9年になった。本年採集した生物は、27種であり、今までに281件を採取している。採集生物リストをTableに示した。バイオアッセイを指標に、今まで、海草、アカフジツボ、クダウミヒドラ、スポンジ、エボヤ、ユーレイボヤ、イソギンチャク、群体ボヤ、オオワレカラ、コケムシ類等につき有用成分の探索を行った。特に、付着生物コケムシ(Bryzoa)類の各種の成分に注目し、各地で採集したフサコケムシBugula neritina、ホソフサコケムシTricellaria occidentalisおよびアメリカのフロリダ産フサコケムシAmathia convolutaの活性成分を検討し、有益な知見と新しい化学物質を単離・構造決定した。すなわち、昨年度報告したconvolutamine AとF以外にconvolutamine Gを、さらにlutamide C以外に、lutamide AとBおよびconvolutamydine Eの単離を行い、構造決定した。さらに、昨年から始めたこれらの有用な天然物の全合成研究に成果が見られ、3種のconvolutamine類A、CとFおよび2種のlutamide類AとCの合計5種の天然物の全合成を完成させた。この成果には、さらにanalogsの全合成を含み、化合物の構造とその活性との相関に研究が発展している。これらの結果は1999年度の日本化学会第75回春季年会で口頭発表され、さらに一部、チェコ化学会誌に掲載されている。これらの成果は、研究成果の概要に報告する。さらにまた、去年度の第75回日本化学会春季年会には、従来発表していなかった成果を再検討し、計5題の研究発表(ポスター)を行った(研究成果の概要を参照)

F. 海洋生物の医薬資源開発 : 医薬を指向した海洋生物の有用物質の探索

海洋生物はその種100万といわれ、地上における今もなお未知な世界である。本年度も、この海洋生物から、医薬資源となりうる有用な生理活性物質を発見し、構造を明らかにし、生物活性を検討することを目的として研究を行った。本年採集した生物は、23種であり、今までに249件を採集している。採集生物のリストをTableに示した。バイオアッセイを目印に、今まで、海草、アカフジツボ、クダウミヒドラ、スポンジ、エボヤ、ユーレイボヤ、イソギンチャク、群体ボヤ、オオワレカラ、コケムシ類等につき有用成分の探索を行った。特に、付着生物コケムシ(Bryzoa)類の各種の成分に注目し、各地で採集したフサコケムシBugula neritina、ホソフサコケムシTricellaria occidentalisおよびアメリカのフロリダ産コケムシAmathia convolutaの活性成分を検討し、有益な知見を得た。また、中国との共同研究が進み、中国側で大量(全1000Kg)のフサコケムシが採集でき、その成分の分離を行っている。特に海南島産フサコケムシから新規ブリオスタチン19を単離し構造を決定した。さらに、昨年度から淡水産のコケムシの一種であるオオマリコケムシをつくば市の沼で採集し、活性成分の探索を開始しており、本年も同じ場所で採集している。淡水産コケムシについての成分研究は、まったく未知であり本研究室が最初である。今までに幾つかの成分を単離している。以上の結果は、成分の成果の項に要約した。一方、かねてより海洋科学技術センターと共同研究を行っていた深海生物の成分探索に進展がみられ、相模湾深海生物のシロウリガイとハオリムシにも抗癌活性物質が存在することを発見し、目下他の様々な成分とあわせその活性成分の検索を進めている。途中の経過は、第14回しんかいシンポジウム(11月、コクヨホール、品川、海洋科学技術センター主催)にて報告した。また、第11回天然薬物の開発と応用シンポジウム(8月、八王子、東京薬科大学、日本薬学会主催)にて招待講演を行い、本プロジェクトの最近の成果を報告している。その他の発表、論文などリストした

<所内学術研究成果報告>D. 「海洋生物の医薬資源開発, 医薬を指向した海洋生物の探索と調査・開発」

海洋はその種100万といわれ, 地上における今もなお未知な世界である。本年度も, この海洋生物から, 医薬資源となりうる有用な生理活性物質を発見し, 構造を明らかにし, 生物活性を検討することを目的として研究を行った。この研究を始めてから11年を経過した。そこで, 本年度は, 新しい生物の採集を中止し, 今までの生物成分のまとめを行った。特に, 日本産ナマコ類成分, 沖縄と真鶴で採集した日本産フサコケムシ成分, および深海巻貝2種の成分研究を完成した

D. 海洋生物の医薬資源開発-医薬を指向した海洋生物の有用物質の探索

海洋生物はその種100万といわれ、地上における今もなお未知な世界である。本年度も、この海洋生物から、医薬資源となりうる有用な生理活性物質を発見し、構造を明らかにし、生物活性を検討することを目的として研究を行った。この研究を始めてから10年になった。本年度採集した生物は、27種であり、今までに309件を採取している。採集生物リストをTableに示した。バイオアッセイを指標に今まで、海草、アカフジツボ、クダウミヒドラ、スポンジ、エボヤ、ユーレイボヤ、イソギンチャク、群体ボヤ、オオワレカラ、コケムシ類等につき有用成分の探索を行った。特に、付着生物コケムシ(Bryozoa)類の各種の成分に注目し、各地で採集したフサコケムシBugula neritina、ホソフサコケムシTricellaria occidentalis及びアメリカフロリダ産コケムシAmathia convolutaの活性成分を検討し、有益な知見と新しい化学物質を単離・構造決定した。すなわち、昨年度報告したconvolutamine AとF以外にconvolutamie Gを、さらにlutamide C以外にlutamide AとB及びconvolutamydine Eの単離を行い、構造決定した。さらに、昨年から始めたこれら有用な天然物の全合成研究に成果が見られ、3種のconvolutamine類A、CとF及び2種のlutamide類AとCの計5種の天然物の全合成を完成させた。この成果には、さらにanalogsの全合成を含み、化合物の構造とその活性との相関に研究が発展している。これらの結果は、日本化学会第76回春季年会(1\u27999/3)で口頭発表し、次いでその後の成果を加え、第19回メディシナルケミストリーシンポジウム第8回日本薬学会医薬化学部会年会(1\u27999/11)で口頭発表した。これらの成果と深海生物研究の成果を学術論文として投稿し、一部掲載が完了している。本年度大槌湾で採集した生物は16種、山田湾では9種を採取した。ホソフサコケムシは採取したが、フサコケムシは見られなかった。コケムシとしては、ほかにアミコケムシとウデコブコケムシを採集した。ウデコブコケムシの量が最も多かった。本年、深海生物としてパプアニューギニア産の巻き貝2種を加えることができた

Scaffold Protein KAP1在轉錄調控及入核功能的探討

轉錄（transcription）在細胞中佔有非常重要的角色，其能調控如細胞增生、分化、凋亡及老化等功能。若細胞無法正常進行轉錄調控時可能導致疾病及癌症發生，而其中調控轉錄的重要因子即為輔因子（cofactor）。目前研究指出輔因子可以當作橋樑來連結DNA/染色質結合蛋白與染色質修飾蛋白。然而，越來越多研究結果指出ㄧ個輔因子可以組裝許多不同的DNA/染色質結合蛋白與染色質修飾蛋白。本計畫中將以KAP1（已知為轉錄抑制輔因子）來了解轉錄輔因子是如何參與在不同轉錄調控的機制。基於我們初步研究結果與訊息傳導的文獻報導，我們認為KAP1可以扮演鷹架式結構蛋白（scaffoldprotein）來調控不同轉錄因子在轉錄及進入細胞核的機制，而其特異性是藉由蛋白之間交互作用以及轉錄後修飾來控制。因此如果能了解KAP1是如何作為 scaffold center來結合不同蛋白複合體，將可以解決現今許多在探討輔因子在轉錄調控及入核機制的問題。目標1. 藉由蛋白質交互作用、scaffold組裝及轉錄實驗來探討KAP1是否具有scaffold蛋白的特性。目標2. 藉由蛋白質交互作用及質譜儀分析來探討KAP1是否能與不同蛋白質結合或不同的轉錄後修飾而有特異性結合。目標3. 藉由scaffold功能分析及入核實驗（nuclear import）來了解KAP1是否形成scaffold複合體來促進結合蛋白入核。Transcription plays a fundamental and regulatory role for all kinds of cellular processesincluding proliferation, differentiation, apoptosis, and senescence. Aberrance in transcriptionmight pave the way for human diseases and cancer progression. One key factor in controllingtranscription is the cofactors. It has been known that cofactors serve as a bridge forprotein-protein interactions between DNA/chromatin-binding factors and chromatinmodifiers. However, this simple model is challenged by increasing evidence, which shows thata single cofactor might serve in different pairs of DNA-binding factors and histone modifiers.To investigate the mechanism of how a single transcriptional cofactor functions in differenttranscriptional regulatory pathways, we will analyze KAP1, a multi-functional cofactorknown in transcriptional repression. Based on our preliminary results and lessons from signaltransduction, we proposed that KAP1 functions as a scaffold protein for different factors intranscriptional regulation and nuclear import, where the specificities are determined by theprotein-protein interactions and post-translational modifications. Uncovering the roles ofKAP1 as a versatile scaffold center for different protein complexes will resolve many currentproblems concerning cofactors' function in transcription and nuclear import. Three specificaims are proposed below.Aim 1. To determine if KAP1 functions as a scaffold protein using protein-proteininteraction assays, scaffold assembly assays, and transcriptional assays.Aim 2. To determine if the scaffold specificity of KAP1 is determined by specificprotein-protein interactions or post-translational modifications using protein-proteininteraction assays and mass spectrometry analysis.Aim 3. To determine if KAP1 forms scaffold complexes for nuclear import pathway byscaffold functional assays and nuclear import assays

HDAC3蛋白複合體之功能及其在人類聽障疾病中的角色

Deafness is a relatively common disorder. Approximately 1 in 800 children was born with a serious and permanent hearing impairment, and very large proportions of the population suffer from progressive hearing loss as they age. Genetic reasons as well as environments causes contribute to deafness in human. However, finding genes implicated in human deafness diseases has never been easy. In the last decade, the approach using techniques in human molecular genetics has found that about 70 loci in the human genome are related to hearing loss. This finding provides further evidence suggesting that the human deafness diseases are complicated disorders and that unknown genes involved are waiting for identification. In the last year, progress in the Human Genome Project and development of murine models of deafness have resulted in rapid discovery of many loci and corresponding genes for deafness. As we knew all along, however, moving from identification of a gene to understanding its function is usually an important and required process. Therefore, we ask: how has the identification of these deafness genes helped our understanding of the molecular basis of auditory function? One approach to answering this question is to study the functional interactions between protein molecules involved in human deafness using methods in proteomics. Recently, our analysis using bioinformatics showed that the human histone deacetylase 3 (HDAC3) gene is located in the loci of DFNA1, a non-syndromic deafness locus, which is mapped to a region within 1 centimorgan on chromosome 5q31 by linkage analysis of deafness. Moreover, we and others recently reported that HDAC3 is involved in several protein complexes. One of these protein complexes contains another human deafness gene TBL1, further suggesting that HDAC3 is one of the most possible human deafness-related genes. In this proposal, I hypothesize that HDAC3 forms a stable protein complex which may regulate gene transcription involved in non-syndromic deafness. To complete this proposal, the following three specific aims are proposed. Aim 1: Purify the HDAC3 protein complex by affinity chromatography and identify each component in the complex by mass spectrometry. Aim 2: Determine whether the components of the complex involve in transcriptional regulation and histone deacetylation by transcriptional assays and HDAC assays, respectively. Aim 3: Determine the downstream target genes of the HDAC3 complex by chromatin immunoprecipitation assays. On completion of this proposal, the discovery of novel genes and protein complexes responsible for deafness will increase our knowledge on hearing loss at the molecular level. This understanding will continue to expand as additional genes are cloned and their functions elucidated, which will, in turn, provide a guide to clinical approaches to diagnosis of and therapy for patients with hearing disorders.功能性基因體及蛋白質體的研究: HDAC3 蛋白複合體之功能及其在人類聽障疾病中的角色耳聾是一種相當常見的疾病。據統計，每八百位在新生兒中就有一位患有先天全聾或是嚴重的聽力障礙。也有為數不少是在成長中漸進發病的。造成耳聾的原因不外是環境因素和基因缺陷。然而，尋找與耳聾相關的基因是相當困難的，特別是無相關症候群型的耳聾 (non-syndromic deafness)。過去十年中，利用分子遺傳學的技術，已經發現70個染色體的位置和人類耳聾有關。這樣的發現也同時說明了耳聾是一種非常複雜的疾病，而有更多未知的相關基因等待去發現。去年，由於人類的基因完全解碼，加上小鼠為實驗的成功動物模式，許多和耳聾相關的重要基因都被發現。但是，我們都了解要從發現一個基因到了解一個基因的功能，永遠是最重要，也是一定要做要走的一步。因此，我們在想，在這些和耳聾有關的基因中，哪些可以幫助我們了解聽力好壞的分子機制？從蛋白質體學的方法及原理來研分子間的交互作用是可以解決回答這些問題的。最近，我們利用生物資訊的技術，發現我們原先選殖的 HDAC3 位於無相關症候群型耳聾 DFNA1 的基因區中 (染色體 5q31)。還有，我們和其他研究人員在許多不同蛋白質體中都發現 HDAC3 的存在。其中一個複合體包含了另一個和耳聾有關的基因 TBL1。這些證據在在地顯示出 HDAC3 極可能和人類重大疾病耳聾有關。在此計劃中，我提出一個假說: HDAC3 行成一個穩定的蛋白複合體，藉由這個蛋白複合體來調控參與和耳聾相關的基因轉錄。三個研究方向目標敘述如下： 方向目標 1: 用親和性蛋白純化層析法和質譜分析儀來純化 HDAC3 蛋白複合體和驗證複合體中的每一個蛋白。 方向目標 2: 測試 HDAC3 蛋白複合體中的每一個蛋白的轉錄抑制功能以及去乙醯脢酵素的活性。 方向目標 3: 利用染色質免疫沉澱法 (ChIP assay) 來分析決定 HDAC3 蛋白複合體的直屬下游基

Studies of the Scaffold Functions of Cofactor Kap1 in Transcription and Nuclear Import

Transcription plays a fundamental and regulatory role for all kinds of cellular processesincluding proliferation, differentiation, apoptosis, and senescence. Aberrance in transcriptionmight pave the way for human diseases and cancer progression. One key factor in controllingtranscription is the cofactors. It has been known that cofactors serve as a bridge forprotein-protein interactions between DNA/chromatin-binding factors and chromatinmodifiers. However, this simple model is challenged by increasing evidence, which shows thata single cofactor might serve in different pairs of DNA-binding factors and histone modifiers.To investigate the mechanism of how a single transcriptional cofactor functions in differenttranscriptional regulatory pathways, we will analyze KAP1, a multi-functional cofactorknown in transcriptional repression. Based on our preliminary results and lessons from signaltransduction, we proposed that KAP1 functions as a scaffold protein for different factors intranscriptional regulation and nuclear import, where the specificities are determined by theprotein-protein interactions and post-translational modifications. Uncovering the roles ofKAP1 as a versatile scaffold center for different protein complexes will resolve many currentproblems concerning cofactors' function in transcription and nuclear import. Three specificaims are proposed below.Aim 1. To determine if KAP1 functions as a scaffold protein using protein-proteininteraction assays, scaffold assembly assays, and transcriptional assays.Aim 2. To determine if the scaffold specificity of KAP1 is determined by specificprotein-protein interactions or post-translational modifications using protein-proteininteraction assays and mass spectrometry analysis.Aim 3. To determine if KAP1 forms scaffold complexes for nuclear import pathway byscaffold functional assays and nuclear import assays.轉錄（transcription）在細胞中佔有非常重要的角色，其能調控如細胞增生、分化、凋亡及老化等功能。若細胞無法正常進行轉錄調控時可能導致疾病及癌症發生，而其中調控轉錄的重要因子即為輔因子（cofactor）。目前研究指出輔因子可以當作橋樑來連結DNA/染色質結合蛋白與染色質修飾蛋白。然而，越來越多研究結果指出ㄧ個輔因子可以組裝許多不同的DNA/染色質結合蛋白與染色質修飾蛋白。本計畫中將以KAP1（已知為轉錄抑制輔因子）來了解轉錄輔因子是如何參與在不同轉錄調控的機制。基於我們初步研究結果與訊息傳導的文獻報導，我們認為KAP1可以扮演鷹架式結構蛋白（scaffoldprotein）來調控不同轉錄因子在轉錄及進入細胞核的機制，而其特異性是藉由蛋白之間交互作用以及轉錄後修飾來控制。因此如果能了解KAP1是如何作為 scaffold center來結合不同蛋白複合體，將可以解決現今許多在探討輔因子在轉錄調控及入核機制的問題。目標1. 藉由蛋白質交互作用、scaffold組裝及轉錄實驗來探討KAP1是否具有scaffold蛋白的特性。目標2. 藉由蛋白質交互作用及質譜儀分析來探討KAP1是否能與不同蛋白質結合或不同的轉錄後修飾而有特異性結合。目標3. 藉由scaffold功能分析及入核實驗（nuclear import）來了解KAP1是否形成scaffold複合體來促進結合蛋白入核