红色荧光蛋白在毕赤酵母中的高效表达

报道了红色荧光蛋白(DsRFP)在毕赤酵母中的高水平表达.利用PCR技术从YEpFLAG- 1 -DsRFP扩增出DsRFP编码序列,克隆到毕赤酵母胞内表达载体pPIC3. 5K构建重组表达载体pPIC3. 5K- DsRFP,电击转化进毕赤酵母,G418 RDB平板双重筛选后获得重组转化子,经MM/MD平板培养与PCR鉴定,重组子全部为HIS+MUT+表型.重组菌株诱导表达48h后获得了高效表达,摇瓶中表达水平达到细胞内总蛋白的12%,表达量达到1. 8g/L.经硫酸铵分级沉淀,DEAE- 5PW阴离子交换柱层析与S- HyperD阳离子交换柱层析后获得电泳纯蛋白.说明我们建立的毕赤酵母表达应用平台具有高效表达外源蛋白的能力

大肠杆菌表达的戊型肝炎病毒ORF2片段的聚合现象研究

在大肠杆菌中表达了戊型肝炎病毒 (HEV)ORF2的a .a .394～a .a .6 0 4片段 ,得到的重组蛋白NE2在SDS PAGE中主要以可被尿素解聚的二聚体形式存在 ,二聚体对病人血清的反应性明显强于单体 ;质谱分析表明NE2可形成从二聚体到至少六聚体的多种聚体 ;动态光散射测定表明平均分子半径约 4nm ,相当于四聚体 ,但分散度较大 ,提示为多种大小不一的聚合体的混合物。这些证据表明NE2蛋白可形成以同源二聚体为基本单位的多种聚合体形式 ,其中以二聚体间的结合最为紧密 ,并且以二聚体为基础可进一步装配出多种更高级结构 ,从而具有作为HEV疫苗及诊断试剂抗原的良好前景

颗粒化重组戊型肝炎病毒衣壳蛋白及其抗原性与免疫原性

过去的研究发现大肠杆菌表达的戊型肝炎病毒 (HEV)衣壳蛋白ORF2的aa3 94_60 6片段NE2可以形成同源多聚体 ,并具有良好的免疫保护性 ,但纯化后的免疫原性较弱。这里表达了 3个NE2蛋白的N端延伸突变体 ,发现对应于ORF2aa3 68_60 6的重组蛋白HEV 2 3 9在体外可以形成颗粒性抗原。HEV 2 3 9抗原颗粒与戊肝患者血清反应性良好 ,对中和性单克隆抗体 8C11的反应性与NE2抗原相当 ,而对另一中和性单克隆抗体 8H3的反应性较NE2抗原有显著提高 ,表明HEV 2 3 9抗原颗粒具有比NE2更好的抗原性。纯化后的HEV 2 3 9抗原颗粒直径约为 15～3 0nm。铝佐剂吸附的HEV 2 3 9免疫Balb c小鼠的半数有效剂量 (ED5 0 )在 0 0 8～ 0 2 5μg之间 ,而同样以铝佐剂吸附的NE2抗原 60 μg剂量免疫的抗体阳转率仅 2 5% ,表明HEV 2 3 9抗原颗粒具有更好的免疫原

戊型肝炎病毒衣壳蛋白中和表位间的构象诱导

重组蛋白NE2包含了戊型肝炎病毒(HEV)衣壳蛋白(pORF2)的aa394～606片段。在NE2上已鉴定出了2个HEV中和表位,并获得了3个识别中和表位的单克隆抗体(MAb)8C11、13D8和8H3。这3个MAb间的交叉阻断ELISA实验发现,8C11和13D8可以彼此完全阻断,8H3对8C11和13D8均不能阻断,而8C11非但不能阻断8H3,反而显著增强了8H3与抗原的结合。用生物传感器进行的抗体与抗原结合的动力学分析也证实了这一现象。这些结果提示,在NE2上8H3表位区域受到抗原上某些结构的掩盖,而8C11与NE2的结合引起了抗原空间结构的改变,导致了掩盖8H3表位的结构的去除和8H3表位的充分暴露。免疫捕获RT PCR发现,8C11同样可以显著增强8H3对天然HEV病毒的捕获能力,提示这种结合诱导的衣壳蛋白空间构象改变在天然HEV病毒颗粒上同样存在

SARS冠状病毒核衣壳(N)蛋白不同区域的原核表达

利用大肠杆菌表达系统对SARS冠状病毒的核衣壳(N)蛋白全长及N末端或/和C末端缺失突变体进行了表达,共表达了39个重组蛋白,表达量在15%～30%之间。分别利用电洗脱或金属鳌合介质纯化重组蛋白,用蛋白印迹实验检测纯化蛋白对SARS病人恢复期血清的反应性,结果发现全长N蛋白活性最好,其余的末端缺失蛋白均无法达到同一活性水平。由此说明N蛋白的完整性对于其优势表位的充分暴露是必要的

戊型肝炎病毒衣壳蛋白同源二聚体的相互作用结构域

为了探讨戊型肝炎病毒衣壳蛋白同源二聚体形成的关键区域和相互作用结构域 ,以及二聚体形成与主要天然中和表位的形成之间的关系 ,通过末端缺失、定点突变技术研究戊型肝炎病毒 (HEV)ORF2的aa394_aa6 0 6片段NE2的聚合现象 ,发现其C端的aa5 97_aa6 0 2 (AVAVLA)疏水区是该片段同源聚合的核心区域 ,提高该区域氨基酸的亲水性将妨碍聚合现象的发生 ;半胱氨酸化学交联实验表明NE2形成同源二聚体时 ,aa5 97在空间位置上相接近 ,处于可生成化学键的距离 ,提示所处区域为疏水聚合的作用结构域 ;通过Blast程序估算核心区域的天然突变率 ,发现其疏水性高度保守 ;N端缺失实验表明 ,至少 6 5个氨基酸既不影响同源聚合也不直接参与主要的天然中和表位的形成 ,但可协助中和表位构象的形成 ,而这种协助作用可被ORF2的末端肽段所代替。aa5 97_aa6 0 2 (AVAVLA)疏水区为戊肝病毒衣壳组装的第一步骤的核心区域 ,并与重要的天然中和表位的形成直接相关 ,从而为戊肝病毒疫苗的研究提供更详细的信息

星状神经节阻滞用于慢性主观性耳鸣困扰的辅助干预效果及预测指标初析

目的探讨星状神经节阻滞（SGB）用于慢性主观性耳鸣困扰的辅助干预效果，及相应的预测指标，为SGB应用于耳鸣的临床干预累积经验。方法回顾因其他干预方案效果不理想而在中山大学附属第三医院耳鼻咽喉-头颈外科接受SGB干预的慢性主观性耳鸣患者资料。SGB干预前进行耳鸣残疾量表（THI）评估、纯音听阈测试、耳鸣响度评估，部分患者接受了睡眠质量（PSQI）评估。SGB干预后复测THI，以评价SGB的干预效果。随后，通过相关分析及线性回归方程探寻预测SGB干预效果的潜在指标。数据的统计分析采用SPSS 24.0进行，P < 0.05表示存在统计学意义。结果至2023年04月，共有107名慢性主观性耳鸣患者接受了SGB干预，其中男性患者67名，女性患者40名，平均（45.32±11.40）周岁，耳鸣持续（20.32±24.64）月［16（12~20）］。有7名患者因个人原因中途退组，退组率6.54%，干预依从性良好。所有患者均未出现穿刺部位感染、血肿、神经损伤、局麻药中毒等不良反应，安全性良好。SGB干预后，有77名患者的THI得分下降至36分及以下，剩余的患者中有12名的THI得分下降幅度达到10分及以上，有效率为89%；配对样本t检验显示，SGB干预前后的THI得分有显著的统计学差异（t = 15.575，P < 0.001），干预效果良好。皮尔逊相关分析显示，干预前的THI得分和耳鸣主观响度与THI的改善水平呈显著的正相关关系（P < 0.05）；进一步的逐步线性回归分析发现，“干预前THI得分”具有显著的统计学意义（P < 0.001），回归系数为0.308，预测了THI改善水平的17.4％。结论SGB干预慢性主观性耳鸣困扰的短期效果良好、安全性高，可用于常规干预方案不理想时（尤其是THI得分较高患者）的补充方案，但后续研究需要明确长期疗效及内在机制，为SGB应用于主观性耳鸣的干预奠定更为扎实的理论基础

集美大学2002级福建籍新生肝炎感染现状

目的　了解集美大学 2 0 0 2级福建籍新生甲、乙、戊 3型肝炎感染情况。方法　采用血清流行病学调查方法。结果　学生中抗HAV -IgG ,HBsAg和抗HEV -IgG阳性率分别为 77.0 8% ,1 5 .2 3 % ,1 7.1 5 % ,地区差异明显 ;HAV ,HEV无性别差异 ,而HBV以男性为高 ;农村HAV和HBV感染率均高于城镇 ,而HEV感染率无城乡差别。结论　应该加强对本地区大学生的甲、乙肝预防 ,急需研究出一种有效的戊肝疫

传染性非典型肺炎病毒核蛋白的表达与活性检测

用PCR方法,人工合成传染性非典型肺炎病毒(SARS-CoV)核蛋白(N)全编码基因,并构建原核表达载体,在大肠杆菌中进行表达。结果重组N蛋白表达产量占菌体总蛋白的40％以上,主要以可溶形式存在。用SARS患者急性期血清进行蛋白印迹检测,表明可溶形式和包含体形式均有明显活性。包含体形式的重组蛋白经纯化后纯度可达90％以上,活性与纯化前相当,可作为SARS抗体诊断试剂盒的抗原原料

Expression of a Series of SARS-CoV nucleocapsid(N) mutants and preparation of monoclonal antibodies against N protein

严重急性呼吸综合征（SARS）是21世纪出现的第一个急性传染病，它是由一种新型冠状病毒—严重急性呼吸综合征冠状病毒病毒（SARS-CoV）引起的。我们根据GeneBank上公布的SARS-CoV基因组序列，以Tor2为蓝本，用PCR方法，人工合成其核衣壳蛋白（N）的全编码基因。构建了融合表达的重组质粒PN422，在大肠杆菌中进行表达。结果重组N蛋白表达产量占菌体总蛋白的40%以上，主要以可溶形式存在。用SARS患者急性期血清进行蛋白印迹检测，表明可溶形式和包含体形式均有明显生物活性。重组N蛋白经金属鳌合层析纯化后纯度可达95%以上，活性与纯化前相当。设计了一系列N末端或C末端缺失或两端都缺失的...Severe acute respiratory syndrome (SARS) was the first severe infectious disease in the 21 century,which was caused by a new coronavirus ,named by WHO as SARS coronavirus (SARS-CoV). From the Genebank we got the genic sequences of Nucleocapsid (N) protein of SARS-CoV. Then according to the sequence of strain Tor2 we synthesized our genic sequence of N protein by the method of PCR. The N gen...学位：理学硕士院系专业：生命科学学院生物学系_生物化学与分子生物学学号：20012602