中国HTLV-Ⅰ env基因的克隆及Ⅰ+Ⅱ型嵌合基因的原核表达与抗原活性检测

为尽快研制出国产HTLV抗体诊断试剂 ,首先从福建HTLV流行区 1名HTLV感染者外周血细胞中克隆出HTLV Ⅰ的全长膜基因 (env) ,继而结合文献报道、PSA软件的亲疏水性分析和EPI软件的B细胞表位分析数据 ,选择了gp46中段开始延伸至 gp2 1N端 2 12个氨基酸 (aa185～aa396 )的基因 ,并在 3′端通过 (GlySer) 2 与人工合成的HTLV Ⅱ型的型特异性表位区基因嵌合 ,插入原核表达载体 pRSET ,在 E .coli中得到了高效表达 ,目的蛋白产量约占菌体总蛋白的 30 %。通过Triton X10 0洗涤 ,低浓度尿素逐步变性处理 ,8mol/L尿素溶解后纯度在 75 %左右 ,经电泳洗脱纯化 ,最终纯度可达 95 %左右 ,纯蛋白得率约 40 %。经Westernblotting检测 ,该蛋白对 4份HTLV Ⅰ型和 2份HTLV Ⅱ型血清均有较强反应 ,而对 4份阴性血清无反应 ,从而有可能用于研制HTLV抗体诊断试剂盒

人表皮生长因子(hEGF)基因的合成、鉴定及植物表达质粒的构建

用 PCR方法合成了人表皮生长因子 ( h EGF)基因 ,构建了原核表达质粒 p2 0 T-h EGF,研究了原核表达的重组蛋白 h EGF的生物学活性 ,并构建了植物表达质粒 .研究表明 :无论是融合蛋白 GST-h EGF或纯化的h EGF蛋白 ,都有相当高的生物活性 ,h EGF蛋白对 Hela细胞的增殖有很好的促进作用 ,免疫小鼠亦能产生很高的免疫应答反应

一种高效、稳定的分泌型原核表达载体的构建及应用

以本室构建的原核表达载体pTO-T7为基础载体,PCR合成ompT引导序列,插入该载体多克隆位点上游,构建了分泌型原核表达载体pTO-OT。将2个外源基因克隆至pTO-OT,2个重组质粒在大肠杆菌中均得以高效表达,表达量为25％-30％。Western印迹分析证实了重组蛋白在大肠杆菌中表达后可被信号肽酶有效识别,切割后的重组蛋白具有良好的免疫学活性。对重组表达菌株的连续传代实验证实了该表达载体具有良好的遗传稳定性,显示了该原核表达载体在基因工程中的应用价值

一种高效、稳定的分泌型原核表达载体的构建及应用

以本室构建的原核表达载体pTO-T7为基础载体,PCR合成ompT引导序列,插入该载体多克隆位点上游,构建了分泌型原核表达载体pTO-OT。将2个外源基因克隆至pTO-OT,2个重组质粒在大肠杆菌中均得以高效表达,表达产量在25％～34％之间。Western blot分析证实了融合蛋白可被大肠杆菌信号肽酶有效地切割,并具有良好的免疫学活性。对重组表达菌株的连续传代实验证实了该表达载体具有良好的表达稳定性,显示了其在基因工程中的应用价值

TT病毒与肝炎关系的临床流行病学研究

目的　对闽南地区各种肝炎患者、健康体检者、义务献血员和肝癌患者共480例从临床流行病学角度探讨TT病毒(TTV)的致病性及其与各种肝炎的关系。方法　采用巢式PCR检测血清TTVDNA、ELISA检测血清抗HAVIgM、HBsAg、抗HBcIgM、抗HCVIgG、抗HEVIgG,用EPIINFO60软件进行统计分析。结果　480名研究对象中TTVDNA的总检出率为23.96%。各种肝炎患者的TTV总阳性率为2394%,肝癌患者的TTV阳性率为2069%,而健康者的TTV阳性率为2484%,义务献血员的阳性率为3000%,均未见明显差别。从临床类型看,急性肝炎、慢性肝炎和重症肝炎的TTV阳性率都在25%左右;从病原类型看,非甲～戊型肝炎的TTV阳性率为2619%,并未见与相应健康者的2523%阳性率的差别;除HCV由于感染率太低而无法分析外,HAV、HBV、HEV阳性肝炎患者间TTV的阳性率分别为2000%、2314%、2179%,未见TTV与这些已知肝炎病毒的明显相关。对一个时期内的全部135例住院肝炎患者及153名健康者进行肝炎病原分析,HAV、HBV、HEV在肝炎患者中的阳性率都要明显高于健康人(P=00142),而TTV在肝炎患者中的阳性率与健康人没有明显差别(P=06021);对病毒的单独致病性进行分析,HAV、HBV、HEV在非重叠感染的肝炎患者中的阳性率都要明显高于健康人(P=00037),而TTV在非甲～戊型肝炎患者中的

闽南地区TT病毒的变异及经输血传播的初步证据

TT virus(TTV)DNA was tested by nested-PCR from sera of hepatitis patients and volunteer blood donors in Minnan area. The amplified segment was a 189 base pair region in TTV ORF2. A total of six sequences were obtained from three non-A to G hepatits patients and two from volunteer blood donors. The sequences were found to be with 82.9% to 99.3% homology to TTV Japanese strain and Chinese strain. The divergence of sequence in these six segments varied from 0.7% to 17.1%, which indicated that the TTV had been existing for a long time in this area. In the serum of a non-A to G hepatitis patient who was negative for TTV DNA in the 14th day of disease course turned to be positive in the 30th day, two TTV sequences were obtained which showed 92.1% nucleotide homology. It indicated that different TTV strains can co exist in the same person. This patient's blood had been transfused ten times between the collection of his TTV negative sample and his positive serum sample. Seven of the blood donors were traced an..

SARS-CoV N蛋白与人冠状病毒HCoV-OC43和HCoV-229E的交叉反应表位及特异表位的确定

为确定SARS-CoV N蛋白的特异抗原表位,对3种人冠状病毒SARS-CoV、HCoV-OC43和HCoV-229E N蛋白之间的交叉免疫反应进行了系统研究。构建了分别表达SARS-CoV、HCoV-OC43和HCoV-229E N蛋白的重组痘苗病毒,并制备了相应的小鼠免疫血清。用间接免疫荧光方法,检测了3种N蛋白的表达及其与3种冠状病毒免疫动物血清和SARS病人恢复期血清之间的反应。与此同时,用Western blot方法分析了原核表达的39个不同区段的SARS-CoV N蛋白与3种冠状病毒动物免疫血清和SARS病人恢复期血清之间的交叉反应性。免疫荧光检测结果表明,SARS-CoV、HCoV-OC43和HCoV-229E3种病毒的N蛋白在重组痘苗病毒感染的HeLa细胞中均可以特异表达;3种N蛋白之间存在明显交叉免疫反应。Western blot结果显示,SARS-CoV N蛋白的表位主要位于30~60aa、170~184aa、301~320aa和360~422aa;与HCoV-OC43的交叉反应表位主要位于30~60aa、90~120aa、204~214aa和320~360aa;与HCoV-229E的交叉反应表位主要位于30~60aa、150~160aa和301~360aa。含SARS-CoV N蛋白特异表位的重组肽N155b(60~214aa)和N185(30~214aa)只与SARS病人恢复期血清和灭活SARS-CoV免疫小鼠的血清反应,而不与灭活HCoV-OC43和HCoV-229E免疫的山羊血清产生交叉反应。上述结果为使用SARS-CoV N蛋白抗原进行特异诊断试剂的研究,提供了重要的实验依据

Elemene reversed the multidurg resistance of A549 /DDP lung cancer cells via mitochondrial apoptosis pathway

目的:探讨榄香烯乳(ElEMEnE,ElE)逆转人肺腺癌耐顺铂(CISPlATIn,ddP)细胞A549/ddP的耐药性及作用机制。方法:采用MTT法检测榄香烯乳单用的细胞毒作用及与ddP合用时耐药逆转作用。荧光探针JC-1结合激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位的变化。dCfH-dA荧光探针结合流式细胞仪检测细胞内活性氧(rEACTIVE OXygEn SPECIES,rOS)水平。用谷胱甘肽试剂盒结合分光光度法检测计算gSH/(gSSg+gSH)比值。蛋白质印迹法检测胞质中CyTO C、PrO-CASPASE-3、CASPASE-3和bCl-2家族蛋白表达情况。结果:不同浓度榄香烯乳抑制A549/ddP细胞株生长,呈时间-剂量依赖性效应,联合顺铂能提高A549/ddP细胞株对顺铂的敏感性而逆转耐药。不同浓度榄香烯乳联合顺铂使A549/ddP细胞株线粒体膜电位下降,rOS浓度增加,gSH/(gSSg+gSH)比值降低,上调胞质中CyTO C、CASPASE-3、bAd蛋白表达,下调PrO-CASPASE-3、bCl-2蛋白表达。结论:榄香烯乳逆转A549/ddP细胞株耐药性可能与其损伤线粒体膜,活化胞内氧化还原体系,诱导线粒体凋亡路径有关。Objective: To explore the mechanism that elemene( ELE) reversed the multidurg resistance( MDR)of A549 /DDP lung adenocarcinoma cell.Methods: MTT assay was used to determine the growth inhibition of human lung adenocarcinoma A549 /DDP cells in vitro.Mitochondrial membrane potential( MMP) was monitored by JC- 1fluorescence probe with laser confocal scanning microscopy,the intercellular reactive oxygen species( ROS) level was measured by 2',7'- dichlorfluorescein- diacetate( DCFH- DA) staining and flow cytometry and the ratio of GSH /( GSSG +GSH) was calculated according to detection results of GSH kit.The expression of Cytochrome C,Caspase-3 and the Bcl- 2 family proteins and in the case of cyclosporine A and DEVD- CHO,the expression of Caspase- 3expression were measured by Western blot.Results: MTT results showed that different concentrations ELE could inhibit the proliferation of A549 /DDP cells in a time- and dose- dependent manner.Intriguingly,ELE plus cisplatin enhanced the sensitivity of A549 /DDP cells to cisplatin and reversed A549 /DDP cells dury resistance.Different concentrations ELE decreased mitochondrial membrane potential,increased intracellular ROS concentration and decreased GSH /( GSSG + GSH) ratio of A549 /DDP cells in a time- and dose- dependent manner.Furthermore,the combination with both ELE and cisplatin also enhanced the protein expression of Cytoplasmic C,Caspase- 3 and Bad,and reduced the protein levels of Bcl- 2 and Pro- caspase- 3 in the cisplatin- resistant A549 /DDP cancer cells.Conclusion: ELE reversed the MDR of A549 /DDP cell line may demage mitochondrial membrane,active intracellular redox system and induce the mitochondrial apopotosis pathway.福建省自然科学基金面上项目(编号:2010D014

戊型肝炎病毒核酸阳性血浆经输血传播感染恒河猴的研究

目的 了解戊型肝炎病毒(HEV)核酸阳性血浆对灵长类动物的感染性和致病性。 方法 对抗-HEV IgM阳性而IgG阴性志愿献血员血浆进行HEV RNA检测,并将存在病毒血症献血员的10ml血浆静脉输入健康恒河猴,观察其对恒河猴的感染性和致病性。 结果 从1份抗-HEV IgM阳性而IgG阴性志愿献血员血浆中分离出HEV基因IV型RNA片段。该份血浆输入恒河猴后,恒河猴出现典型急性肝炎生物化学和病理表现,病毒血症,血清抗-HEV IgM和IgG抗体阳转。 结论 HEV病毒血症献血员血浆输入可以引起灵长类动物的HEV感染以及急性肝炎,提示HEV经输血传播的可能性