Expression of organophosphorus-degradation gene(opd) in aggregating and non-aggregating filamentous nitrogen-fixing cyanobacteria

Genetic engineering in filamentous N2-fixing cyanobacteria usually involves Anabaena sp.PCC 7120 and several other non-aggregating species.Mass culture and harvest of such species are more energy consuming relative to aggregating species.To establish a gene transfer system for aggregating species,we tested many species of Anabaena and Nostoc,and identified Nostoc muscorum FACHB244 as a species that can be genetically manipulated using the conjugative gene transfer system.To promote biodegradation of organophosphorus pollutants in aquatic environments,we introduced a plasmid containing the organophosphorus-degradation gene(opd) into Anabaena sp.PCC 7120 and Nostoc muscorum FACHB244 by conjugation.The opd gene was driven by a strong promoter,PpsbA.From both species,we obtained transgenic strains having organophosphorus-degradation activities.At 25°C,the whole-cell activities of the transgenic Anabaena and Nostoc strains were 0.163±0.001 and 0.289±0.042 unit/μg Chl a,respectively.However,most colonies resulting from the gene transfer showed no activity.PCR and DNA sequencing revealed deletions or rearrangements in the plasmid in some of the colonies.Expression of the green fluorescent protein gene from the same promoter in Anabaena sp.PCC 7120 showed similar results.These results suggest that there is the potential to promote the degradation of organophosphorus pollutants with transgenic cyanobacteria and that selection of high-expression transgenic colonies is important for genetic engineering of Anabaena and Nostoc species.For the first time,we established a gene transfer and expression system in an aggregating filamentous N2-fixing cyanobacterium.The genetic manipulation system of Nostoc muscorum FACHB244 could be utilized in the elimination of pollutants and large-scale production of valuable proteins or metabolites

Using Neural Network with Self-Feedback to Solve the Four-Coloring Problem

Takefuji et al. proposed a method to the four-coloring problem using the McCulloch-Pitts neuron type neural network and obtained good results. However, the method is always difficult to converge on the minimum value (correct answer). In this paper we propose a method to solve the four-coloring problem by the neural network using the McCulloch-Pitts neuron with self-feedback. Moreover, we rewrite the motion equation by adding the self-feedback term of neuron so that the state of neuron before updating can be held in the network. We apply the method to the four-coloring problem, and perform the simulations to three kinds of maps: 48,110,210 regions. The results show that the minimum value (correct answer) can be obtained at high speed and high success rate. Moreover, the simulation results show that the proposed method is better than other methods. (author abst.)本論文では，自己フィードバックを持つMcCu llochPittsニューロンを用いたニューラルネットワークによる四色問題の一解法を提案する. 本解法では，Takefujiらと同様に，問題に含まれる解の状態をニューロンの出力状態で表現し，最適解に対応する状態で最小となるエネルギ一関数を定義している. 更に，本論文では，ニューロンの動作式に自己フィードバックを持たせることで，更新前のニューロンの状態を保持し，かつ，特定の条件の制約だけは満たすようにニューロンの状態を更新する解法を提案する. シミュレーション結果より，四色問題は本論文で提案する解法を用いることで，極小値に陥ることがほとんどなく，高い成功率で高速に最小値（正解）を得ることができることを示す

細菌蛋白毒素のcyclic ADP-ribose合成酵素活性の検出

金沢大学医学部1.NAD分解酵素活性を検出する際に、従来のマイクロタイタ-プレート蛍光法を改良し、簡便に酵素活性を定量化できるように工夫して、大量の試料を取り扱えるようにした。2.上記方法を用いて種々の細菌の培養上清および菌体抽出液をスクリーニングしたところ、ある種の細菌の培養上清はNAD分解酵素活性が非常に高いことがわかった。3.この細菌の培養上清について、研究実施計画3)に記した方法でcADP-ribose合成活性を測定したところ、同活性を示すことが明らかになった。4.この培養上清からcADP-ribose合成酵素の精製を行った。硫安塩析、およびゲルろ過、イオン交換、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによって精製した。5.精製した酵素を用いてさらに詳細な解析を行い、本酵素がcADP-ribose合成活性のみならずcADP-ribose分解活性をも有していることを明らかにした。6.本酵素について、反応速度と時間の関係、至適pHおよび金属イオンの酵素活性に与える影響について検討した。以上の結果から、真核生物のみならず原核生物でも、cADP-ribose合成・分解酵素活性を有する蛋白を産生することを明らかにした(論文投稿中)。今後は、分子量・等電点・アミノ酸解析・Km・Vmax等の検討によって同酵素の酵素学的性状を明らかにすることを中心に研究を進める予定である。研究課題/領域番号:06770198, 研究期間(年度):1994出典：研究課題「細菌蛋白毒素のcyclic ADP-ribose合成酵素活性の検出」課題番号06770198（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-06770198/）を加工して作

レンサ球菌のサイクリックADPリボース代謝酵素の一次構造の決定と活性部位の解析

金沢大学大学院医学系研究科1.レンサ球菌サイクリックADPリボース(cADPR)代謝酵素N末アミノ酸配列に相当する遺伝子断片のクローニング精製酵素のN末アミノ酸配列を決定し、PCR用オリゴヌクレオチドプライマーを作製した。種々の条件を検討しながらA群レンサ球菌DNAを鋳型にPCRを行った結果、予想される大きさのDNA断片(120bp)が増幅された。このDNA断片をクローニングし、塩基配列を決定したところ、レンサ球菌cADPR代謝酵素をコードする遺伝子の一部であることが判明した。2.cADPR代謝酵素遺伝子塩基配列(1次構造)の決定と発現系の構築上記120bpDNA断片をプローブにして行ったサザンブロット解析をもとに、染色体遺伝子プラスミドライブラリーを構築した。次に、プラスミドベクター上に設計したプライマーと120bpDNA断片上のプライマーによりsingle specific primer-PCRを行い、その増幅産物の塩基配列を決定した。目的遺伝子は全長1,353bpで451アミノ酸残基の分子量50,703の蛋白質をコードしていた。精製酵素のN末端との比較から,37アミノ酸残基のシグナル領域を持つことが推定された。また、このレンサ球菌cADPR合成・分解酵素は1次構造上、cADPR代謝活性を示す酵素である哺乳動物リンパ球表面抗原CD38、骨髄幹細胞抗原BST-1やアメフラシADP-ribosyl cyclaseとの相同性は認められなかった。決定した塩基配列をもとに、PCRを用いて本酵素構造遺伝子全長をクローニングし、大腸菌内で発現させた。その結果、ウェスタンブロット解析にて元株と同じ位置にバンドが検出され、酵素アッセイにてNAD分解活性・cADPR代謝活性が確認された。以上のことからレンサ球菌cADPR合成・分解酵素は新しいタイプのcADPR代謝酵素であると考えられた。1. Cloning of a DNA fragment corresponding to the N-terminus amino acid sequence of streptoccal NAD^+-glycohydrolaseAn N-terminus amino acid sequence of streptococcal NAD^+-glycohydrolase was determined by using the purified enzyme. To amplify a DNA fragment which corresponded to the N-terminus amino acid sequence, PCR-primers were designed and PCR was done. A DNA fragment which had the expected size (120 bp) was amplified. The nucleotide and the deduced amino acid sequences of this fragment revealed that this fragment was a part of the gend encoding NAD^+-glycohydrolase.2. Primary structure of the gene encoding NAD^+-glycohydrolase and construction of its expression systemSouthern blot analysis was done using the 120-bp DNA fragment. It was shown that the gene encoding NAD^+-glycohydrolase was contained as a single copy in chromosome. Plasmid libraries of chromosomal DNA from Streptococcus pyogenes C2556 were constructed. Single specific-PCR was preformed using primers designed from sequences of the plasmid and of the 120-bp DNA fragment. The nucleotide sequence of the amplicon was determined. The open reading frame was ca.1400 bp. Calculated molecular weight and pI were ca.50,000 and 8.5, respectively. These properties were consistent with those of the purified enzyme. Full length of the gene encoding NAD^+-glycohydrolase was cloned and expressed in Escherichia coli. Cell extracts showed not only NAD^+-glycohydrolase activity bu also cyclic ADP-ribose-synthesis and -hydrolysis activities. Enzymatic active portions are currently under investigation.研究課題/領域番号:08670303, 研究期間(年度):1996-1997出典：研究課題「レンサ球菌のサイクリックADPリボース代謝酵素の一次構造の決定と活性部位の解析」課題番号08670303（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/report/KAKENHI-PROJECT-08670303/086703031997kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/）を加工して作

レンサ球菌サイクリックADPリボース合成・分解酵素によるIgスイッチ組み換え

金沢大学大学院医学系研究科1.ある種の細胞において、精製レンサ球菌cADPR合成・分解酵素の添加によって細胞増殖抑制が観察された。この細胞増殖抑制効果はNADを添加した状態でも観察された。この細胞増殖抑制効果は,L929細胞Vero細胞、CHO細胞等の細胞株では観察されなかった。ハイブリドーマ細胞株を用いて、免疫グロブリンクラス・サブクラスの変化を観察したが、明確な免疫グロプリンクラススイッチは検出できなかった。2.これまで本酵素をStreptococcus pyogenesの培養上清から精製してきたが、in vivo酵素投与を行うには大量の酵素が必要となる。そのためHistidine-tag、GST fusion、Intein fusion等を導入したcADPR合成・分解酵素遺伝子を構築し大腸菌に発現させて、簡単に本酵素を精製する可能性を模索してきた。結果として、行った全ての試みは成功しなかった。その主たる理由は、塩基配列の確認も含めベクターの構築に問題はないが、大腸菌において発現させるうちにベクター中の挿入配列部に遺伝子変異が起こることにあった。以上の状況から,大腸菌を用いた通常のfusion protein発現系を本酵素に用いることは困難であると結論づけられた.3.急性咽頭炎からのβ溶血性レンサ球菌(BHS)の分離(1)1患者から培養した初代培養寒天平板上のBHSコロニーの血清群・血清型はhomogeneousであった。(2)一般に頻用されている迅速診断キットではA群BHS以外の群は検出できないことを考慮すると,少数ではあるがA群以外のBHSによる咽頭炎が存在することに注意する必要がある.(3)コミュニティにおいて棲息するA群BHSは,常にダイナミツクに入れ替わっている。1. Distinct evidence of Ig class switch was not obtained when hybridoma cells were incubated with purified streptococcal ADP ribosyl cyclase/cADPR hydrolase.2. The microbiologic status of streptococcal pharyngitis in pediatric outpatients was investigated. Children with clinical diagnosis of acute pharyngitis were enrolled. Of 360 specimens examined, 96 (26.7%) were beta hemplytic streptococci (BHS)-positive. The isolates were homogeneous for Lancefield\u27s group and T antigen. Although group A was predominant (90 isolates, 93.8%), groups B (two isolates, 2.1%), C (one isolate, 1.0%), and G (three isolates, 3.1%) were also detected. It should be noticed that non-group A streptococci can not be detected with the currently used rapid antigen-detection tests. The results of T-serotyping suggest that human migration during summer vacation may provide an opportunity for streptococci to colonize in new hosts.研究課題/領域番号:12670251, 研究期間(年度):2000-2001出典：研究課題「レンサ球菌サイクリックADPリボース合成・分解酵素によるIgスイッチ組み換え」課題番号12670251（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/report/KAKENHI-PROJECT-12670251/126702512001kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/）を加工して作