Controlled biotechnological production of polyhydroxyalkanoates

Předložená diplomová práce se zabývá produkcí polyhydroxyalkanoátů (PHA) bakterií Cupriavidus necator H16. Cílem práce byla příprava, selekce a charakterizace mutantních kmenů schopných vyšší produkce PHA. V teoretické části byla zpracována literární rešerše zabývající se nejdůležitějšími typy PHA, bakterií Cupriavidus necator a způsoby indukce mutageneze. V experimentální části byly připraveny mutantní kmeny pomocí fyzikální a chemické mutageneze. Mutantní kmeny schopné nadprodukce PHA byly selektovány pomocí kultivace na minerálním médium s olejem. Pro další studium byly vybrány 4 mutantní kmeny schopné nadprodukce PHA. Tyto mutantní kmeny byly dále podrobeny biochemické charakterizaci. Byly naměřeny specifické aktivity vybraných intracelulárních enzymů včetně enzymů podílejících se na biosyntéze PHA. Také byla naměřena resistence mutantů vůči oxidačnímu stresu. Bylo zjištěno, že mutantní kmeny schopné nadprodukce PHA mají vyšší aktivity enzymů produkujících NADPH. NADPH je jeden z klíčových substrátů ovlivňujících směr toku acetyl-CoA metabolizmem. Vyšší intracelulární koncentrace NADPH parciálně inhibuje Krebsův cyklus a aktivuje akumulaci PHA. Aktivity acetoacetyl-CoA reduktázy a PHA syntázy, enzymů zapojených do syntézy PHA, těchto mutantů proto byly také vyšší stejně jako molekulová hmotnost připravených polymerů. Aplikace fyzikálních a chemických mutagenů je způsob, kterým lze připravit biotechnologicky perspektivní mutantní kmeny schopné nadprodukce PHA.This diploma thesis deals with production of polyhydroxyalkanoates (PHA) by bacterial strain Cupriavidus necator H16. Goal of this work was preparation, selection and characterization of mutant strains overproducing PHA. Theoretical focuses on the most important PHA, bacteria Cupriavidus necator and mutagenesis techniques. In practical part mutant strains were prepared through physical and chemical mutagenesis. Mutant strains overproducing PHA were selected by cultivation in mineral medium with oil. For further study, 4 mutant strains overproducing PHA were selected. These mutants were biochemically characterized. Specific activities of several intracellular enzymes including enzymes involved in PHA biosynthesis were measured. Resistance of mutants against oxidative stress was measured as well. Mutant strains overproducing PHA revealed higher enzymatic activities of NADPH producing enzymes. Generally, NADPH is one of the substrates influencing flux of acetyl-CoA throughout the metabolism; higher intracellular concentration of NADPH partially inhibits TCA cycle and activates accumulation of PHA. Therefore, activities of acetoacetyl-CoA reductase and PHB synthase, enzymes directly involved in PHA synthesis were higher as compared to wild strain as well as molecular weight of produced materials. It can be concluded that biotechnologically perspective mutagens capable of PHA overproduction can be prepared by application of chemical and physical mutagens.

Controlled production of polyhydroxyalcanoates by bacterial strain Ralstonia eutropha using different substrates

Předložená bakalářská práce se zabývá produkcí polyhydroxyalkanoátů (PHA) bakterií Ralstonia eutropha. Ke snížení nákladů na vstupní surovinu byla studována produkce PHA s využitím různých typů substrátů. V teoretické části byla zpracována literární rešerše zabývající se nejdůležitějšími typy PHA, produkčními kmeny a možností kultivace bakterie Ralstonia eutropha na různých typech nutričních zdrojů. V praktické části byla studována produkce PHA na různých rostlinných olejích, včetně využití odpadních olejů z různých zdrojů (restaurace, domácnosti, potravinářské podniky). Dále byla v těchto olejích studována inkorporace prekurzorů za účelem řízené produkce kopolymerů. Nejvyšších výtěžků poly-3-hydroxybutyrátu (P3HB) bylo dosaženo použitím odpadních olejů. Z ekonomických a ekologických důvodů jsou tyto oleje velmi vhodným substrátem. Při použití odpadního řepkového oleje z menzy o koncentraci 20 g/l bylo v 84. hodině kultivace získáno 13,32 g/l biomasy s obsahem P3HB 58,63%. Při studiu inkorporace prekurzorů bylo nejvyšších výtěžků dosaženo aplikací 1% propanolu ve 24. hodině, kdy došlo k navýšení výtěžku PHA o 97 %. Vniklý PHA obsahoval 91% 3HB a 9 % 3-hydroxyvalerátu.This bachelor’s thesis deals with production of polyhydroxyalkanoates (PHA) by bacterial strain Ralstonia eutropha. Production of PHA on different substrates has been studied to lower the costs of feedstock. In theoretical part the review has been done about the most important types of PHA, production strains and possibilities of cultivation of Ralstonia eutropha using different substrates. In practical part there has been studied production of PHA on different vegetable oils, including waste oils from different sources (restaurants, homes, food companies). Incorporation of different precursors for copolymer production control was studied too. The highest yields of poly-3-hydroxybutyrate (P3HB) have been achieved using waste oils. For economical and ecological reasons these oils are very suitable substrates. Using concentration 20 g/l of waste rapeseed oil from university canteen there has been produced 13,32 g/l of biomass containing 58,63% of P3HB in 84th hour of cultivation. The highest yield of PHA in precursors study has been achieved applying 1% propanol in 24th hour of cultivation. The PHA increase has been 97%. This PHA was composed from 91% of 3HB and 9% of 3-hydroxyvalerate.

Brewer´s spent yeasts for oenology: from characterisation to must fermentation

In order to follow the principles of the circular economy, the spent brewer´s yeasts were in this work evaluated to be considered as a raw material for production of yeast derivatives for oenology. They provide natural source of organic nutrition, improve organoleptic properties and physico-chemical stability of wines. In this work, the spent yeasts from different beer styles were evaluated for their primary characteristics. Three types of yeast derivatives were prepared, inactive yeasts used for active dry yeast rehydration, lysates for organic nitrogen supply during fermentation and yeast hulls for adsorption of fermentation inhibitors. The chemical properties, fermentation kinetics and aromatic compounds formation of spent yeast derivatives were comparable to the well-recognized commercial products. However, the sensory analysis of final wines revealed bread-like and yeast autolysis off-flavors