Streptomyces clavuligerus proteomiği-optimizasyon

TÜBİTAK KBAG15.05.2015Streptomyces clavuligerus, sefamisin C antibiyotiği, bir beta laktamaz inhibitörü olan klavulanik asit ve anti-fungal ve antibakteriyel özelliğe sahip başka klavam bileşikleri üretmektedir. Bu metabolitlerin üretimi ve biyosentezi regülatör metabolizmaya bağlı kompleks regülatör moleküllerin etkileşimini gerektirmektedir (Liras vd., 2008). Streptomyces, dirençlilik, transport, biyosentetik enzimleri kodlayan genlere fiziksel olarak bağlı ya da onlar tarafından regüle edilen regülatör genleri içeren ve böylelikle antibiyoitk biyosentezini düzenleyen gen kümelerine sahiptir (Chater ve Bibb, 1997; Alexander ve Jensen, 1998). Proteomik analizler, Streptomyces’te daha önce karakterize edilmemiş hücresel dinamikleri ve bileşenleri açığa çıkarma potansiyeline sahiptir. Ayrıca proteomik yöntemler kullanılarak belirli koşullar altında ekspresyon seviyelerinde meydana gelen önemli değişimlerin 2D jel elektroforez yöntemi kullanılarak belirlenebileceği ve böylelikle istenen ikincil metabolitlerin üretiminin arttırılmasına yönelik organizmada değişiklikler yapılabileceği gibi (Chaudhary vd., 2013) Streptomyces’te antibiyotik üretimi ve ikincil metabolizma ile bağlantı gösteren morfolojik değişim mekanizmaları açığa çıkarılabilir (Zhou vd., 2011). S.clavuligerus türü için henüz belirlenmiş ve optimize edilmiş bir protein ekstraksiyon metodu ve 2D protein profili çıkarma yöntemi yoktur. Bu çalışmada 4 farklı protein ekstraksiyon yöntemi denenerek ve gerektiği durumlarda modifikasyonlar yapılarak, her ekstraksiyon için 2D jelleri hazırlanmış ve jeller birbirleriyle Delta2D programı ile karşılaştırılarak, protein miktarı ve yoğunluğu, ekstraksiyon yönteminin verimliliği açısından en uygun yöntem olan Fenol Ekstraksiyon yöntemi I (Faurobert vd., 2007) seçilmiştir. Böylelikle ileride yapılacak S.clavuligerus proteom çalışmalarımızın ilk ve en önemli basamağı için optimize bir yöntem belirlemiş bulunmaktayız.Streptomyces clavuligerus produces cephamycin C antibiotic, the β-lactamase inhibitor clavulanic acid, and several other clavam compounds that show antibacterial and antifungal activities. The production and biosynthesis of these metabolites requires the interplay of complex regulatory molecules linked to the regulatory metabolism (Liras vd., 2008). Streptomyces possess gene clusters that orchestrate the biosynthesis of these antibiotics, which include resistance, transport, regulatory genes physically linked and regulated with genes encoding biosynthetic enzymes (Chater and Bibb, 1997; Alexander and Jensen, 1998). Proteomic analyses have the potential to reveal previously uncharacterized components and dynamics in the cellular networks in streptomycetes. Furthermore, the mechanism of differentiation which is correlated with antibiotic production and secondary metabolism in streptomycetes can be understood by proteomics (Zhou et al., 2011) as much as significant changes in expression levels under certain conditions by using 2D gel electrophoresis can be detected and used for engineering the organisms for the increase of secondary metabolites of interest (Chaudhary et al., 2013). There has been no optimized procedure for the protein extraction from S. clavuligerus yet. In this study, 4 different protein extraction methods with the modifications on them if needed were used to prepare 2D gels and those gels were compared with each other by using Delta2D program with respect to their spot number, density and the efficiency of the extraction method so that Phenol Extraction Method I (Faurobert et al., 2007) was chosen as the most suitable protein extraction method, which is the first and the most important step for the S. clavuligerus proteomic studies that will be performed in the future

Basilsin biyosentezinin susturulduğu bir bacillus subtilis mutantında dinamik sekretom değişimlerinin analizi.

The members of the genus Bacillus produce a wide variety of secondary metabolites with antimetabolic and pharmacological activities. Bacilysin, being produced and excreted by certain strains of B. subtilis, is a dipeptide antibiotic composed of L-alanine and L-anticapsin which is synthesized enzymatically. As shown earlier by our research group, the expression of bacilysin biosynthetic operon (bacA) is relatively constant during the exponential growth, but increases during the transition between exponential and stationary phases and reaches to its maximal level upon entry into stationary phase (16th hour). We also reported for the first time that the expression of bacA operon is under the control of several elements of quorum sensing global regulatory pathway of sporulation initiation and competence development as well as those of some essential two-component pleiotropic regulator proteins that play the critical role in a variety of cellular functions, including the adaptation to nutrient-limiting conditions, motility, chemotaxis and biofilm formation. More recently, we performed comparative cytosolic proteome analysis in the bacilysin producer B. subtilis PY79 and its bacilysin-knock out derivative, OGU1, by using a combination of 2DE MALDI-TOF/MS and GeLC-MS/MS approaches with the aim of identifying functional roles of bacilysin biosynthesis in its producer. Yet, these studies did not cover extracellular proteins of the organisms which could point to some other important physiological alterations in response to the bacilysin knock out mutation. The secretome of B. subtilis is known to change at the beginning of the sporulation phase to include new membrane- and wall-binding proteins as well as those secreted outside, like new degradative enzymes that may provide the cells with new nutrients and those engaged in detoxification, communication, defense and many more. As a Gram-positive organism, the absence of an outer membrane in Bacillus subtilis simplifies protein secretion pathways and allow the organism to secrete high levels of extracellular proteins. The present study aims at an investigation of dynamic changes in the secretome of B. subtilis in the absence of bacilysin production by employing both 2 DE gel-based and gelfree approaches, to improve protein coverage as a function of time and space. At different time points of 12, 16 and 24 hours of cultivation in glucose-based synthetic medium, the secretome components were analyzed, identified and compared in the parental strain PY79 and its and bacilysin knock out mutant OGU1. LC-MS/MS analyses identified a total of 2075 distinct proteins. Of these, a total of 166 proteins were found to be differentially expressed between two strains. As expected, the numbers of total and differentially expressed proteins identified were much lower in 2DE MALDI-TOF/MS approach, still its results well supported the findings from LC-MS/MS analyses. Overall, the differentially expressed proteins mainly belonged the functional categories of transport and metabolism, genetic processes, lifestyle, coping with stress, sporulation and germination and those unknown. The alterations should mainly be regarded to represent a defense or stress-coping mechanism assuming that the absence of bacilysin is sensed by the mutant as a type of stress condition. The present study greatly aided in a comprehensive understanding of whole proteomic alterations in the bacilysin knock-out mutant that remains to be supported by further functional analyses.Ph.D. - Doctoral Progra

PASTEURELLA MULTOCIDA'YA AİT plpE VE ompH PROTEİNLERİ KULLANILARAK TAVUK KOLERASINA KARŞI AŞI STRATEJİLERİNİN GELİŞTİRİLMESİ

PASTEURELLA MULTOCIDA'YA AİT plpE VE ompH PROTEİNLERİ KULLANILARAK TAVUK KOLERASINA KARŞI AŞI STRATEJİLERİNİN GELİŞTİRİLMES

Bacillus subtilis Standart Suş (PY79) ile Basilisinin Bloke Edildiği Suşun (OGU1) Karşılaştırmalı Dinamik Sekretom Analizi

TÜBİTAK KBAG Proje15.08.2018Bacillus türleri, antimetabolik ve farmakolojik aktiviteye sahip çok çeşitli ikincil metabolitlerüretmektedir. B. subtilis?e ait biyoaktif peptidlerin etkilerinin sadece antimikrobiyal aktivite ilesınırlı olmadığı bilinmektedir. B. subtilis tarafından üretilen basilisin, N-terminalinde L-alanineand C-terminalinde non-proteinojenik bir amino asit olan L-anticapsin?den oluşan dipeptidyapısı ile bilinen en küçük antibiyotiktir. Basilisin biyosentezinin dinamikleri ve molekülerregülasyonu ile ilgili literatür bilgilerinin çoğu grubumuz tarafından rapor edilmiştir.Biyosentezin hücre yoğunluğu sinyali global kontrol mekanizmasının bir parçası olduğu,transpozon mutajenez kütüphanesinin taranmasıyla gen düzeyinde anlaşılmış ve bu[Spo0K(Opp)?ye dayalı regülasyon ağı içerisinde ComQ/ComX, PhrC (CSF), ComP/ComAelementleri] ve transkripsiyon faktörler ComA, Spo0A, AbrB ve CodY?nin bac operonuüzerine etkileri, transkripsiyonal füzyon ve EMSA analizleri ile tarafımızca doğrulanmıştır.Önceki araştırmalarımızda basilisin üreticisi standart suş PY79 ve bunun basilisin operonunubloke ederek oluşturduğumuz derivatifi OGU1?a ait sitozolik proteomların oldukça detaylı biranalizi yapılmıştır.Bu çalışmada, jele dayalı ve jelden bağımsız iki ayrı yaklaşım kullanılarak sekretom analizi vebu suretle ulaşılabilen proteinlerin sayısının arttırılmasıyla B. subtilis?de basilisin üretimiyokluğunda ortaya çıkan sekretom değişimlerinin zaman ve mekan olarak dinamik bir analiziamaçlanmıştır. Kültivasyonun 12., 16. ve 24. saatlerinde mevcut sekretom bileşenleritanımlanmış ve PY79 ve basilisin üretemeyen türevi OGU1 arasında farklılık gösterenproteinler ve seviyeleri nicel olarak belirlenmiştir. LC-MS/MS analizlerinde toplam 2075protein tanımlanabilmiştir. Tanımlanabilen proteinlerin 166?sının iki suş arasında farklı ifadeedilen proteinler olduğu gösterilmiştir. Beklenildiği üzere, 2DE MALDI TOF/MS yaklaşımı ileelde edilen protein sayıları çok daha düşük olmuşsa da, sonuçlar LC-MS/MS analiz bulgularıile uyumludur. Yine seçilen genler özelinde gerçekleştirilen qRT PCR çalışmaları daproteomik bulguları çok büyük ölçüde desteklemiştir. Bütünüyle ele alındığında, OGU1?defarklı ifade edilen proteinlerin transport ve metabolizma, genetik prosesler, yaşam biçimi,strese uyum, sporulasyon ve jerminasyon gibi fonksiyonal kategorilere ait olduğugösterilmiştir. Çalışmamız, basilisin yokluğunda sekretom kompozisyonundaki değişimlerinkapsamlı biçimde anlaşılmasını ve bu değişimlerde basilisin operonunun muhtemel rolünündeğerlendirilmesi gerekliliğine işaret etmiş olup mevcut bulguların daha ileri fonksiyonelçalışmalarla desteklenmesi hedeflenmektedir.The members of the genus Bacillus produce a wide variety of secondary metabolites withantimetabolic and pharmacological activities. Bacillus subtilis peptide antibiotics are known toshow distinct roles beyond‘pure’ antimicrobial action. Bacilysin, being produced andexcreted by B. subtilis, is the simplest peptide antibiotic composed of only an N-terminal L-alanine and L-anticapsin, a non-proteinogenic C-terminal amino acid. It was shown by ourgroup that the biosynthesis of bacilysin is under the control of quorum sensing globalregulation in a Spo0K (Opp)-dependent manner and the regulatory effects of ComQ/ComX,PhrC (CSF), ComP/ComA as well as the transcriptional factors ComA, Spo0A, AbrB andCodY on the expression of bacilysin biosynthetic operon was demonstrated by transcriptionalfusion and EMSA analyses. We recently compared cytosolic proteomes of bacilysin producerPY79 and its bacilysin-knock-out derivative, OGU with the aim of identifying functional rolesof bacilysin biosynthesis in its producer.An insight into this dynamic process for secreted proteins would shed light on yet unknowncontrols, hence the present study aimed at identifying differentially expressed secretedproteins in these organisms using a combination of 2DE MALDI TOF/MS and LC-MS MS atdifferent time points of 12, 16 and 24 hours of cultivation. LC-MS/MS identified a total of2075 distinct proteins and 166 were found to be differentially expressed between two strains.As expected, the numbers were much lower in 2DE approach, still its results well supportedthe findings from LC-MS/MS. Q RT PCR performed for selected genes also well accordedwith the proteomic findings. Overall, the differentially expressed proteins mainly belonged tothe functional categories of transport and metabolism, genetic processes, lifestyle, copingwith stress, sporulation and germination.The present study greatly aided in acomprehensive understanding of dynamic secretome alterations in the absence of bacilysinthat remains to be further analyzed by functional studies

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ/LİSANSÜSTÜ TEZ PROJESİ

BASİLİSİNİN BLOKE EDİLDİĞİ MUTANT BACİLLUS SUBTİLİS SUŞUNA AİT SECRETOME DEĞİŞİMLERİNİN ANALİZ

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ/LİSANSÜSTÜ TEZ PROJESİ

PASTEURELLA MULTOCİDA'YA AİT PLPE VE OMPH PROTEİNLERİ KULLANILARAK TAVUK KOLERASINA KARŞI AŞI STRATEJİLERİNİN GELİŞTİRİLMES