De novo analysis of the haustorial transcriptome of the cucurbit powdery mildew fungus Podosphaera xanthii reveals new candidate secreted effector proteins

Backgrounds. Cucurbit crops are affected, among other pathogens, by the obligate biotrophic fungus Podosphaera xanthii, the main causal agent of powdery mildew in cucurbits. This fungus develops a specialized structure of parasitism termed haustorium. Haustoria are developed into epidermal cells and are responsible for nutrients uptake and effectors delivery. Objectives. The aim of this study was to obtain the haustorial transcriptome of P. xanthii to complete the panel of effector candidates of this fungal pathogen. Methods. To obtain the haustorial transcriptome, we have developed an effective method for isolation of haustoria without contaminants by flow cytometry. The cDNA library was built using a combination of dT primers and random primers followed by a depletion of ribosomal sequences. Sequencing was carried out by Illumina NextSeq550. Conclusions. After bioinformatic analysis, we were able to identify 25 new effector candidates secreted by the classic pathway (with signal peptide) and 269 new candidates secreted by the non-classic pathway (without signal peptide). Most proteins had no functional annotation. By protein modelling and ligand predictions, we are now being able to assign putative functions to some of these candidates to select those with potential roles in pathogenesis for subsequent functional in vivo analysis by HIGS (host-induced gene silencing). By these approaches, we are starting to shed some light into the molecular mechanisms of pathogenesis in this very important pathogen of cucurbits.This work was supported by a grant from the Ministerio de Economía y Competitividad (AGL2013-41938-R), co-financed with FEDER funds (EU). A grant form Universidad de Málaga, Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech, is also acknowledged

Impact of motility and chemotaxis features of the rhizobacterium Pseudomonas chlororaphis PCL1606 on its biocontrol of avocado white root rot

The biocontrol rhizobacterium Pseudomonas chlororaphis PCL1606 has the ability to protect avocado plants against white root rot produced by the phytopathogenic fungus Rosellinia necatrix. Moreover, PCL1606 displayed direct interactions with avocado roots and the pathogenic fungus. Thus, nonmotile (flgK mutant) and non-chemotactic (cheA mutant) derivatives of PCL1606 were constructed to emphasize the importance of motility and chemotaxis in the biological behaviour of PCL1606 during the biocontrol interaction. Plate chemotaxis assay showed that PCL1606 was attracted to the single compounds tested, such as glucose, glutamate, succinate, aspartate and malate, but no chemotaxis was observed to avocado or R. necatrix exudates. Using the more sensitive capillary assay, it was reported that smaller concentrations (1 mM) of single compounds elicited high chemotactic responses, and strong attraction was confirmed to avocado and R. necatrix exudates. Finally, biocontrol experiments revealed that the cheA and fglK derivative mutants reduced root protection against R. necatrix, suggesting an important role for these biological traits in biocontrol by P. chlororaphis PCL1606. [Int Microbiol 20(2):94-104 (2017)]Keywords: Pseudomonas chlororaphis · Rosellinia necatrix · avocado white root rot · multitrophic interactions · rhizospher

El análisis RNA-seq dual como herramienta para el estudio de la interacción melón-Podosphaera xanthii

El cultivo de las cucurbitáceas en España se ve afectado, entre otros, por el hongo biotrofo obligado Podosphaera xanthii, principal agente causal del oídio de las cucurbitáceas. Este patógeno representa uno de los factores limitantes más importantes de estos cultivos, incrementando los costes de producción y limitando el rendimiento. Actualmente, la aplicación de fungicidas continúa siendo la principal herramienta de lucha contra esta enfermedad. Sin embargo, el control químico es más ineficaz de lo esperado debido a la facilidad con la que P. xanthii desarrolla resistencias. Profundizar en la biología básica del oídio de las cucurbitáceas se hace indispensable para el desarrollo de medidas de control más racionales y duraderas. Para ello, en este trabajo se ha realizado un análisis RNA-seq dual de la interacción P. xanthii – melón con el fin de comprender, de manera global, las interacciones moleculares que ocurren entre el patógeno y el huésped,a través de la cuantificación de los cambios de expresión génica en los primeros estadios de desarrollo de la enfermedad (0, 24, 48 y 72 hpi). Con los datos obtenidos se ha realizado un análisis time course y un posterior enriquecimiento funcional, que nos ha permitido diferenciar la dinámica de expresión génica de P. xanthii, así como aquellos genes que siguen un patrón característico de sobreexpresión y represión en melón como consecuencia de la infección. Todo ello nos aporta una información muy útil para comprender mejor como se desarrolla la interacción P.xanthii –melón y nos acerca un poco más al desarrollo de nuevos métodos de control eficaces.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Transcriptoma haustorial de Podosphaera xanthii. Retos en muestras de difícil aislamiento y ARN degradado

El cultivo de las cucurbitáceas en España se ve afectado, entre otros, por el biotrofo obligado Podosphaera xanthii, principal agente causal del oídio de las cucurbitáceas. Este hongo, que requiere células vegetales vivas para completar su ciclo de vida asexual, desarrolla unas estructuras especializadas de parasitismo denominadas haustorios. Los haustorios se desarrollan dentro de las células epidérmicas y son responsables de la relación directa entre el patógeno y el huésped a través de la absorción de los nutrientes de la planta y la liberación de efectores. La realización de un transcriptoma haustorial y la definición de su secretoma nos ayudará a conocer mejor los mecanismos de patogénesis de P. xanthii. Esto nos ha llevado a desarrollar un método eficaz de aislamiento de haustorios y un protocolo de creación de librerías de cDNA para muestras de ARN degradado, así como un análisis bioinformático adaptado para ensamblar de novo un transcriptoma con estas características. Mediante citometría de flujo hemos conseguido aislar haustorios de P. xanthii sin apenas contaminantes. Además, a partir de RNA haustorial de baja calidad, hemos construido librerías de cDNA mediante la combinación de una amplificación por oligo dT y cebadores al azar, seguida de una eliminación parcial de las secuencias ribosomales. La secuenciación del transcriptoma se llevó a cabo mediante la plataforma NextSeq550 (Illumina), obteniéndose un alto número de lecturas. En estos momentos estamos realizando el ensamblaje de transcritos y la anotación de los mismos mediante un abordaje bioinformático que combina softwares de distinto tipo. Esperamos poder identificar un elevado número de efectores candidatos que nos permita la identificación de genes clave para la patogénesis de P. xanthii mediante estudios de genómica funcional. Este trabajo ha sido financiado por ayudas del Plan Nacional de I+D+I del Ministerio de Economía y Competitividad (AGL2013-41939-R), cofinanciado con fondos FEDER (UE).Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

El modelado proteico como herramienta para el análisis funcional de efectores haustoriales de Podosphaera xanthii

Los oídios son patógenos biotrofos obligados que requieren células vegetales vivas para completar su ciclo de vida asexual. Podosphaera xanthii, principal agente causal del oídio de las cucurbitáceas, es uno de los patógenos más destacados que limitan la productividad de estos cultivos en España. Este hongo desarrolla unas estructuras especializadas de parasitismo denominadas haustorios que prosperan dentro de las células epidérmicas y son responsables de la relación directa entre el patógeno y el huésped, participando en la absorción de nutrientes de la planta y en la liberación de efectores en las células del huésped. Con el objetivo de identificar genes clave para la patogénesis de Podosphaera xanthii y, partiendo del transcriptoma haustorial y del correspondiente secretoma analizados previamente en nuestro laboratorio, se ha realizado el modelado de las proteínas asociadas a diferentes contigs que carecen de anotación funcional y que pudieran corresponder a proteínas efectoras secretadas candidatas, con la intención de dilucidar su posible función en la interacción patógeno-planta mediante similaridad estructural con proteínas cristalografiadas disponibles en bases de datos. Aunque esta aproximación no es definitiva, nos aporta una valiosa información para realizar el posterior análisis funcional in vivo e identificar aquellos genes clave en la patogénesis de P. xanthii. Los resultados obtenidos arrojan una serie de proteínas cuyas funciones, según los modelos predichos y su comparación posterior con proteínas cristalografiadas, parecen estar directamente relacionadas con distintos aspectos de la patogénesis. Por ello, hemos establecido el modelado proteico como el primer paso del proceso de análisis funcional de proteínas secretadas efectoras candidatas sin función conocida de P. xanthii.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

DNA-Aptamers as a novel strategy in agriculture to control the gray mold disease caused by Botrytis cinerea.

Botrytis cinerea, the causal agent of the gray mold disease, is one of the main limiting factors of horticultural crops production worldwide. Its control is very dependent on the use of fungicides; however, this fungus has been categorized by FRAC (Fungicide Resistance Action Committee) as a high-risk pathogen for fungicide resistance development. In addition, and according to the "farm to fork" strategy of the European Green Deal, the diversity of fungicides available to growers will be reduced by 50% in 2030. For all these reasons, new advances and technologies are needed to control this important harvest and postharvest disease. Aptamers, also called chemical antibodies, are small synthetic single-stranded DNA or RNA molecules that fold into unique three-dimensional structures, allowing them to bind specifically to a target molecule with high stability. In this work, two DNA aptamers against the SOD1 protein of B. cinerea (BcSOD1) were developed. BcSOD1 is involved in the virulence/pathogenicity of B. cinerea as it catalyses the dismutation of the superoxide-ion, produced as a host plant defence system. To test the effectiveness of both aptamers, sensitivity assays (effect on conidia germination, detached leaf, and fruit assays), fungal biomass analysis and aptamer uptake studies were carried out. The results showed that both aptamers were taken by the fungus and inhibited the conidia germination of B. cinerea by 60%. Furthermore, it was demonstrated that both were able to reduce B. cinerea growth and fungal biomass by 50% and 60%, respectively, on tomato leaves and apple fruit. These results demonstrate the potential, for the first time in agriculture, of DNA aptamers to be novel candidates that could be included within the different strategies to control the gray mold disease.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Suppression of Chitin-Triggered Immunity by Plant Fungal Pathogens: A Case Study of the Cucurbit Powdery Mildew Fungus Podosphaera xanthii.

Fungal pathogens are significant plant-destroying microorganisms that present an increasing threat to the world’s crop production. Chitin is a crucial component of fungal cell walls and a conserved MAMP (microbe-associated molecular pattern) that can be recognized by specific plant receptors, activating chitin-triggered immunity. The molecular mechanisms underlying the perception of chitin by specific receptors are well known in plants such as rice and Arabidopsis thaliana and are believed to function similarly in many other plants. To become a plant pathogen, fungi have to suppress the activation of chitin-triggered immunity. Therefore, fungal pathogens have evolved various strategies, such as prevention of chitin digestion or interference with plant chitin receptors or chitin signaling, which involve the secretion of fungal proteins in most cases. Since chitin immunity is a very effective defensive response, these fungal mechanisms are believed to work in close coordination. In this review, we first provide an overview of the current understanding of chitin-triggered immune signaling and the fungal proteins developed for its suppression. Second, as an example, we discuss the mechanisms operating in fungal biotrophs such as powdery mildew fungi, particularly in the model species Podosphaera xanthii, the main causal agent of powdery mildew in cucurbits. The key role of fungal effector proteins involved in the modification, degradation, or sequestration of immunogenic chitin oligomers is discussed in the context of fungal pathogenesis and the promotion of powdery mildew disease. Finally, the use of this fundamental knowledge for the development of intervention strategies against powdery mildew fungi is also discussedPartial funding for open access charge: Universidad de Málag

La biosíntesis de aminoácidos azufrados en los oídios depende de una enzima fúngica no canónica y de dos genes de la planta

Podosphaera xanthii es el principal agente causal del oídio de las cucurbitáceas. En este estudio se pretende proporcionar nuevas perspectivas sobre la biotrofia de P. xanthii que puedan ser de utilidad para el desarrollo de nuevas herramientas de fitoprotección. Para ello, hemos centrando nuestra atención en el metabolismo del azufre. Hasta la fecha, en los genomas de oídios disponibles no se han encontrado los genes de las enzimas involucradas en los pasos iniciales de la ruta de asimilación de azufre y de biosíntesis de aminoácidos azufrados. Sin embargo, el estudio de un conjunto de proteínas conservadas no anotadas deducidas del transcriptoma de P. xanthii, permitió identificar una de las enzimas involucradas en la asimilación de azufre inorgánico. Por otro lado, los resultados obtenidos a partir de un análisis RNA-seq de los primeros estadios de la infección en melón, mostraron un gran número de genes de la planta desregulados, entre los que se encontraban dos de los genes del metabolismo del azufre no identificados en oídios. Sobre esta base, los resultados de ensayos de silenciamiento génico y de complementación química, nos llevaron a concluir que la biosíntesis de aminoácidos azufrados en los oídios podría depender de una enzima fúngica no canónica y de dos genes de la planta. Este trabajo ha sido financiado por ayudas de la Agencia Estatal de Investigación (AEI) (AGL2016-76216-C2-1-R; PID2019-107464RB-C21), cofinanciada con fondos FEDER (EU). Laura Ruiz Jiménez es beneficiaria de un contrato predoctoral (BES-2017-080414) para la formación de doctores del Ministerio de Ciencia e Innovación.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

El análisis mediante RNA-seq y técnicas de captura de imagen de la interacción melón-Podosphaera xanthii revela modulación de la fotosíntesis y del metabolismo secundario de la planta por el patógeno

La familia de las cucurbitáceas incluye especies con gran relevancia económica entre las que destacan melón, sandía, calabacín, pepino y calabaza. Estos cultivos se ven afectados, entre otros, por el hongo biotrofo obligado Podosphaera xanthii, principal agente causal del oídio de las cucurbitáceas. El conocimiento sobre las bases moleculares de las interacciones entre P. xanthii y las diferentes especies de cucurbitáceas es, aún, muy limitado. Por ello, en este trabajo se ha realizado un análisis RNA-seq con el fin de conocer los cambios de expresión génica ocurridos en melón durante los primeros estadios de la enfermedad (24, 48 y 72 hpi). Además, estas fases tempranas de la enfermedad también fueron estudiadas usando técnicas de captura de imágenes como fluorescencia multiespectral y termografía. El análisis bioinformático permitió detectar 1.114 genes de la planta diferencialmente expresados a 24 h, 3.785 a 48 h y 4.226 a 72 h. El posterior enriquecimiento funcional reveló que los principales procesos que se estaban viendo modulados durante la infección eran la fotosíntesis y varias rutas metabólicas relacionadas con la defensa vegetal, resultados que fueron corroborados mediante las técnicas de captura de imagen. La combinación de ambas técnicas nos ha permitido comprender mejor el desarrollo de esta enfermedad desde dos enfoques diferentes pero complementarios e integradores.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech. Este trabajo ha sido financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad (AGL2013-41939-R; AGL2016-76216-C2-1-R) cofinanciado con fondos FEDER (UE). Álvaro Polonio es beneficiario de un contrato predoctoral para la formación de doctores del Ministerio de Economía y Competitividad. Los autores también agradecen ayudas de la Universidad de Málaga, Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech, para la asistencia a este congreso

Resistance to the SDHI fungicides boscalid and fluopyram in podosphaera xanthii populations from commercial cucurbit fields in spain

El oídio de las cucurbitáceas es causado por Podosphaera xanthii, y es una de las enfermedades más importantes que atacan a los cultivos de cucurbitáceas españoles. La aplicación de fungicidas es la principal herramienta de control; sin embargo, su eficacia se ve afectada por el rápido desarrollo de resistencia a estos compuestos. En este estudio, se determinó la CE50 de 26 aislados en respuesta a los Inhibidores del Succinato Deshidrogenasa (o fungicidas SDHI) boscalida y fluopiram. Con estos datos, se dedujeron las dosis discriminatorias y se emplearon para una monitorización de resistencia a los fungicidas SDHI durante las campañas de cultivo del 2018 y 2019. De los 298 analizados, el 37.9% mostraron Resistencia a boscalida y el 44% a fluopiram. Aunque se observaron diferentes fenotipos en el ensayo de discos de hoja, los aislados resistentes mostraron el mismo fenotipo en los ensayos en planta. En comparación con los aislados sensibles, se encontraron dos cambios aminoacídicos en la subunidad SdhC, A86V y G151R. que estaban asociados mayoritariamente con los patrones de resistencia a fluopiram y boscalida, respectivamente. Además, no se encontraron diferencias significativas en términos de supervivencia entre los aislados sensibles y resistentes analizados. Finalmente, se Desarrolló la técnica de Amplificación Isotérmica mediada por Bucle (o LAMP, por sus siglas en inglés) para detectar las mutaciones A86V y G151R usando conidios obtenidas directamente desde material infectado. Nuestros resultados muestras que los agricultores pueden continuar empleando boscalida y fluopiram, pero se necesita implementar prácticas para el manejo de la resistencia.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech