De novo analysis of the haustorial transcriptome of the cucurbit powdery mildew fungus Podosphaera xanthii reveals new candidate secreted effector proteins

Backgrounds. Cucurbit crops are affected, among other pathogens, by the obligate biotrophic fungus Podosphaera xanthii, the main causal agent of powdery mildew in cucurbits. This fungus develops a specialized structure of parasitism termed haustorium. Haustoria are developed into epidermal cells and are responsible for nutrients uptake and effectors delivery. Objectives. The aim of this study was to obtain the haustorial transcriptome of P. xanthii to complete the panel of effector candidates of this fungal pathogen. Methods. To obtain the haustorial transcriptome, we have developed an effective method for isolation of haustoria without contaminants by flow cytometry. The cDNA library was built using a combination of dT primers and random primers followed by a depletion of ribosomal sequences. Sequencing was carried out by Illumina NextSeq550. Conclusions. After bioinformatic analysis, we were able to identify 25 new effector candidates secreted by the classic pathway (with signal peptide) and 269 new candidates secreted by the non-classic pathway (without signal peptide). Most proteins had no functional annotation. By protein modelling and ligand predictions, we are now being able to assign putative functions to some of these candidates to select those with potential roles in pathogenesis for subsequent functional in vivo analysis by HIGS (host-induced gene silencing). By these approaches, we are starting to shed some light into the molecular mechanisms of pathogenesis in this very important pathogen of cucurbits.This work was supported by a grant from the Ministerio de Economía y Competitividad (AGL2013-41938-R), co-financed with FEDER funds (EU). A grant form Universidad de Málaga, Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech, is also acknowledged

Impact of motility and chemotaxis features of the rhizobacterium Pseudomonas chlororaphis PCL1606 on its biocontrol of avocado white root rot

The biocontrol rhizobacterium Pseudomonas chlororaphis PCL1606 has the ability to protect avocado plants against white root rot produced by the phytopathogenic fungus Rosellinia necatrix. Moreover, PCL1606 displayed direct interactions with avocado roots and the pathogenic fungus. Thus, nonmotile (flgK mutant) and non-chemotactic (cheA mutant) derivatives of PCL1606 were constructed to emphasize the importance of motility and chemotaxis in the biological behaviour of PCL1606 during the biocontrol interaction. Plate chemotaxis assay showed that PCL1606 was attracted to the single compounds tested, such as glucose, glutamate, succinate, aspartate and malate, but no chemotaxis was observed to avocado or R. necatrix exudates. Using the more sensitive capillary assay, it was reported that smaller concentrations (1 mM) of single compounds elicited high chemotactic responses, and strong attraction was confirmed to avocado and R. necatrix exudates. Finally, biocontrol experiments revealed that the cheA and fglK derivative mutants reduced root protection against R. necatrix, suggesting an important role for these biological traits in biocontrol by P. chlororaphis PCL1606. [Int Microbiol 20(2):94-104 (2017)]Keywords: Pseudomonas chlororaphis · Rosellinia necatrix · avocado white root rot · multitrophic interactions · rhizospher

El análisis RNA-seq dual como herramienta para el estudio de la interacción melón-Podosphaera xanthii

El cultivo de las cucurbitáceas en España se ve afectado, entre otros, por el hongo biotrofo obligado Podosphaera xanthii, principal agente causal del oídio de las cucurbitáceas. Este patógeno representa uno de los factores limitantes más importantes de estos cultivos, incrementando los costes de producción y limitando el rendimiento. Actualmente, la aplicación de fungicidas continúa siendo la principal herramienta de lucha contra esta enfermedad. Sin embargo, el control químico es más ineficaz de lo esperado debido a la facilidad con la que P. xanthii desarrolla resistencias. Profundizar en la biología básica del oídio de las cucurbitáceas se hace indispensable para el desarrollo de medidas de control más racionales y duraderas. Para ello, en este trabajo se ha realizado un análisis RNA-seq dual de la interacción P. xanthii – melón con el fin de comprender, de manera global, las interacciones moleculares que ocurren entre el patógeno y el huésped,a través de la cuantificación de los cambios de expresión génica en los primeros estadios de desarrollo de la enfermedad (0, 24, 48 y 72 hpi). Con los datos obtenidos se ha realizado un análisis time course y un posterior enriquecimiento funcional, que nos ha permitido diferenciar la dinámica de expresión génica de P. xanthii, así como aquellos genes que siguen un patrón característico de sobreexpresión y represión en melón como consecuencia de la infección. Todo ello nos aporta una información muy útil para comprender mejor como se desarrolla la interacción P.xanthii –melón y nos acerca un poco más al desarrollo de nuevos métodos de control eficaces.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Transcriptoma haustorial de Podosphaera xanthii. Retos en muestras de difícil aislamiento y ARN degradado

El cultivo de las cucurbitáceas en España se ve afectado, entre otros, por el biotrofo obligado Podosphaera xanthii, principal agente causal del oídio de las cucurbitáceas. Este hongo, que requiere células vegetales vivas para completar su ciclo de vida asexual, desarrolla unas estructuras especializadas de parasitismo denominadas haustorios. Los haustorios se desarrollan dentro de las células epidérmicas y son responsables de la relación directa entre el patógeno y el huésped a través de la absorción de los nutrientes de la planta y la liberación de efectores. La realización de un transcriptoma haustorial y la definición de su secretoma nos ayudará a conocer mejor los mecanismos de patogénesis de P. xanthii. Esto nos ha llevado a desarrollar un método eficaz de aislamiento de haustorios y un protocolo de creación de librerías de cDNA para muestras de ARN degradado, así como un análisis bioinformático adaptado para ensamblar de novo un transcriptoma con estas características. Mediante citometría de flujo hemos conseguido aislar haustorios de P. xanthii sin apenas contaminantes. Además, a partir de RNA haustorial de baja calidad, hemos construido librerías de cDNA mediante la combinación de una amplificación por oligo dT y cebadores al azar, seguida de una eliminación parcial de las secuencias ribosomales. La secuenciación del transcriptoma se llevó a cabo mediante la plataforma NextSeq550 (Illumina), obteniéndose un alto número de lecturas. En estos momentos estamos realizando el ensamblaje de transcritos y la anotación de los mismos mediante un abordaje bioinformático que combina softwares de distinto tipo. Esperamos poder identificar un elevado número de efectores candidatos que nos permita la identificación de genes clave para la patogénesis de P. xanthii mediante estudios de genómica funcional. Este trabajo ha sido financiado por ayudas del Plan Nacional de I+D+I del Ministerio de Economía y Competitividad (AGL2013-41939-R), cofinanciado con fondos FEDER (UE).Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

El modelado proteico como herramienta para el análisis funcional de efectores haustoriales de Podosphaera xanthii

Los oídios son patógenos biotrofos obligados que requieren células vegetales vivas para completar su ciclo de vida asexual. Podosphaera xanthii, principal agente causal del oídio de las cucurbitáceas, es uno de los patógenos más destacados que limitan la productividad de estos cultivos en España. Este hongo desarrolla unas estructuras especializadas de parasitismo denominadas haustorios que prosperan dentro de las células epidérmicas y son responsables de la relación directa entre el patógeno y el huésped, participando en la absorción de nutrientes de la planta y en la liberación de efectores en las células del huésped. Con el objetivo de identificar genes clave para la patogénesis de Podosphaera xanthii y, partiendo del transcriptoma haustorial y del correspondiente secretoma analizados previamente en nuestro laboratorio, se ha realizado el modelado de las proteínas asociadas a diferentes contigs que carecen de anotación funcional y que pudieran corresponder a proteínas efectoras secretadas candidatas, con la intención de dilucidar su posible función en la interacción patógeno-planta mediante similaridad estructural con proteínas cristalografiadas disponibles en bases de datos. Aunque esta aproximación no es definitiva, nos aporta una valiosa información para realizar el posterior análisis funcional in vivo e identificar aquellos genes clave en la patogénesis de P. xanthii. Los resultados obtenidos arrojan una serie de proteínas cuyas funciones, según los modelos predichos y su comparación posterior con proteínas cristalografiadas, parecen estar directamente relacionadas con distintos aspectos de la patogénesis. Por ello, hemos establecido el modelado proteico como el primer paso del proceso de análisis funcional de proteínas secretadas efectoras candidatas sin función conocida de P. xanthii.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

La biosíntesis de aminoácidos azufrados en los oídios depende de una enzima fúngica no canónica y de dos genes de la planta

Podosphaera xanthii es el principal agente causal del oídio de las cucurbitáceas. En este estudio se pretende proporcionar nuevas perspectivas sobre la biotrofia de P. xanthii que puedan ser de utilidad para el desarrollo de nuevas herramientas de fitoprotección. Para ello, hemos centrando nuestra atención en el metabolismo del azufre. Hasta la fecha, en los genomas de oídios disponibles no se han encontrado los genes de las enzimas involucradas en los pasos iniciales de la ruta de asimilación de azufre y de biosíntesis de aminoácidos azufrados. Sin embargo, el estudio de un conjunto de proteínas conservadas no anotadas deducidas del transcriptoma de P. xanthii, permitió identificar una de las enzimas involucradas en la asimilación de azufre inorgánico. Por otro lado, los resultados obtenidos a partir de un análisis RNA-seq de los primeros estadios de la infección en melón, mostraron un gran número de genes de la planta desregulados, entre los que se encontraban dos de los genes del metabolismo del azufre no identificados en oídios. Sobre esta base, los resultados de ensayos de silenciamiento génico y de complementación química, nos llevaron a concluir que la biosíntesis de aminoácidos azufrados en los oídios podría depender de una enzima fúngica no canónica y de dos genes de la planta. Este trabajo ha sido financiado por ayudas de la Agencia Estatal de Investigación (AEI) (AGL2016-76216-C2-1-R; PID2019-107464RB-C21), cofinanciada con fondos FEDER (EU). Laura Ruiz Jiménez es beneficiaria de un contrato predoctoral (BES-2017-080414) para la formación de doctores del Ministerio de Ciencia e Innovación.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

El análisis mediante RNA-seq y técnicas de captura de imagen de la interacción melón-Podosphaera xanthii revela modulación de la fotosíntesis y del metabolismo secundario de la planta por el patógeno

La familia de las cucurbitáceas incluye especies con gran relevancia económica entre las que destacan melón, sandía, calabacín, pepino y calabaza. Estos cultivos se ven afectados, entre otros, por el hongo biotrofo obligado Podosphaera xanthii, principal agente causal del oídio de las cucurbitáceas. El conocimiento sobre las bases moleculares de las interacciones entre P. xanthii y las diferentes especies de cucurbitáceas es, aún, muy limitado. Por ello, en este trabajo se ha realizado un análisis RNA-seq con el fin de conocer los cambios de expresión génica ocurridos en melón durante los primeros estadios de la enfermedad (24, 48 y 72 hpi). Además, estas fases tempranas de la enfermedad también fueron estudiadas usando técnicas de captura de imágenes como fluorescencia multiespectral y termografía. El análisis bioinformático permitió detectar 1.114 genes de la planta diferencialmente expresados a 24 h, 3.785 a 48 h y 4.226 a 72 h. El posterior enriquecimiento funcional reveló que los principales procesos que se estaban viendo modulados durante la infección eran la fotosíntesis y varias rutas metabólicas relacionadas con la defensa vegetal, resultados que fueron corroborados mediante las técnicas de captura de imagen. La combinación de ambas técnicas nos ha permitido comprender mejor el desarrollo de esta enfermedad desde dos enfoques diferentes pero complementarios e integradores.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech. Este trabajo ha sido financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad (AGL2013-41939-R; AGL2016-76216-C2-1-R) cofinanciado con fondos FEDER (UE). Álvaro Polonio es beneficiario de un contrato predoctoral para la formación de doctores del Ministerio de Economía y Competitividad. Los autores también agradecen ayudas de la Universidad de Málaga, Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech, para la asistencia a este congreso

Resistance to the SDHI fungicides boscalid and fluopyram in podosphaera xanthii populations from commercial cucurbit fields in spain

El oídio de las cucurbitáceas es causado por Podosphaera xanthii, y es una de las enfermedades más importantes que atacan a los cultivos de cucurbitáceas españoles. La aplicación de fungicidas es la principal herramienta de control; sin embargo, su eficacia se ve afectada por el rápido desarrollo de resistencia a estos compuestos. En este estudio, se determinó la CE50 de 26 aislados en respuesta a los Inhibidores del Succinato Deshidrogenasa (o fungicidas SDHI) boscalida y fluopiram. Con estos datos, se dedujeron las dosis discriminatorias y se emplearon para una monitorización de resistencia a los fungicidas SDHI durante las campañas de cultivo del 2018 y 2019. De los 298 analizados, el 37.9% mostraron Resistencia a boscalida y el 44% a fluopiram. Aunque se observaron diferentes fenotipos en el ensayo de discos de hoja, los aislados resistentes mostraron el mismo fenotipo en los ensayos en planta. En comparación con los aislados sensibles, se encontraron dos cambios aminoacídicos en la subunidad SdhC, A86V y G151R. que estaban asociados mayoritariamente con los patrones de resistencia a fluopiram y boscalida, respectivamente. Además, no se encontraron diferencias significativas en términos de supervivencia entre los aislados sensibles y resistentes analizados. Finalmente, se Desarrolló la técnica de Amplificación Isotérmica mediada por Bucle (o LAMP, por sus siglas en inglés) para detectar las mutaciones A86V y G151R usando conidios obtenidas directamente desde material infectado. Nuestros resultados muestras que los agricultores pueden continuar empleando boscalida y fluopiram, pero se necesita implementar prácticas para el manejo de la resistencia.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Long-term outcomes of high-risk HR-positive and HER2-negative early breast cancer patients from GEICAM adjuvant studies and El Álamo IV registry

Purpose The monarchE trial showed that the addition of abemaciclib improves efficacy in patients with high-risk early breast cancer (EBC). We analyzed the long-term outcomes of a population similar to the monarchE trial to put into context the potential benefit of abemaciclib. Methods HR-positive/HER2-negative EBC patients eligible for the monarchE study were selected from 3 adjuvant clinical trials and a breast cancer registry. Patients with ≥ 4 positive axillary lymph nodes (N +) or 1–3 N + with tumor size ≥ 5 cm and/or histologic grade 3 and/or Ki67 ≥ 20%, who had undergone surgery with curative intent and had received anthracyclines ± taxanes and endocrine therapy in the neoadjuvant and /or adjuvant setting were included. We performed analysis of Invasive Disease-Free Survival (iDFS), Distant Disease-Free Survival (dDFS) and Overall Survival (OS) at 5 and 10 years, as well as yearly (up to 10) of Invasive Relapse Rate (IRR), Distant Relapse Rate (DRR) and Death Rate (DR). Results A total of 1,617 patients were analyzed from the GEICAM-9906 (312), GEICAM-2003–10 (210), and GEICAM-2006–10 (160) trials plus 935 from El Álamo IV. With a median follow-up of 10.1 years, the 5 and 10 years iDFS rates were 75.2% and 57.0%, respectively. The dDFS and OS rates at 5 years were 77.4% and 88.8% and the respective figures at 10 years were 59.7% and 70.9%. Conclusions This data points out the need for new therapies for those patients. A longer follow-up of the monarchE study to see the real final benefit with abemaciclib is warranted

The haustorial transcriptome of the cucurbit pathogen Podosphaera xanthii reveals new insights into the biotrophy and pathogenesis of powdery mildew fungi.

Podosphaera xanthii is the main causal agent of powdery mildew disease in cucurbits and is responsible for important yield losses in these crops worldwide. Powdery mildew fungi are obligate biotrophs. In these parasites, biotrophy is determined by the presence of haustoria, which are specialized structures of parasitism developed by these fungi for the acquisition of nutrients and the delivery of effectors. Detailed molecular studies of powdery mildew haustoria are scarce due mainly to difficulties in their isolation. Therefore, their analysis is considered an important challenge for powdery mildew research. The aim of this work was to gain insights into powdery mildew biology by analysing the haustorial transcriptome of P. xanthii. Prior to RNA isolation and massive-scale mRNA sequencing, a flow cytometric approach was developed to isolate P. xanthii haustoria free of visible contaminants. Next, several commercial kits were used to isolate total RNA and to construct the cDNA and Illumina libraries that were finally sequenced by the Illumina NextSeq system. Using this approach, the maximum amount of information from low-quality RNA that could be obtained was used to accomplish the de novo assembly of the P. xanthii haustorial transcriptome. The subsequent analysis of this transcriptome and comparison with the epiphytic transcriptome allowed us to identify the importance of several biological processes for haustorial cells such as protection against reactive oxygen species, the acquisition of different nutrients and genetic regulation mediated by non-coding RNAs. In addition, we could also identify several secreted proteins expressed exclusively in haustoria such as cell adhesion proteins that have not been related to powdery mildew biology to date. This work provides a novel approach to study the molecular aspects of powdery mildew haustoria. In addition, the results of this study have also allowed us to identify certain previously unknown processes and proteins involved in the biology of powdery mildews that could be essential for their biotrophy and pathogenesis