Three-dimensional experiments and individual based simulations show that cell proliferation drives melanoma nest formation in human skin tissue

Background Melanoma can be diagnosed by identifying nests of cells on the skin surface. Understanding the processes that drive nest formation is important as these processes could be potential targets for new cancer drugs. Cell proliferation and cell migration are two potential mechanisms that could conceivably drive melanoma nest formation. However, it is unclear which one of these two putative mechanisms plays a dominant role in driving nest formation. Results We use a suite of three-dimensional (3D) experiments in human skin tissue and a parallel series of 3D individual-based simulations to explore whether cell migration or cell proliferation plays a dominant role in nest formation. In the experiments we measure nest formation in populations of irradiated (non-proliferative) and non-irradiated (proliferative) melanoma cells, cultured together with primary keratinocyte and fibroblast cells on a 3D experimental human skin model. Results show that nest size depends on initial cell number and is driven primarily by cell proliferation rather than cell migration. Conclusions Nest size depends on cell number, and is driven primarily by cell proliferation rather than cell migration. All experimental results are consistent with simulation data from a 3D individual based model (IBM) of cell migration and cell proliferation

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Obtenção e padronização de esferoides derivados de diferentes linhagens de melanoma em mono e cocultura com macrófagos

Orientadora: Prof.ª Dr.ª Carolina Camargo de OliveiraCoorientador: Prof. Dr. Daniel de Lima BellanDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia celular e molecular. Defesa : Curitiba, 30/08/2022Inclui referências: p. 84-100Resumo: Modelos tridimensionais vêm sendo vastamente utilizados por representar a arquitetura dos tecidos in vivo, fator que está extremamente relacionado com comportamento celular. É interessante a utilização desses modelos com células tumorais pois características como as do microambiente tumoral podem ser mimetizadas. O microambiente tumoral também se caracteriza pela presença de células não tumorais, em especial macrófagos, que podem ser cocultivados tridimensionalmente, criando assim uma plataforma para, por exemplo, testar novos fármacos. Considerando isso, o objetivo deste trabalho foi obter e padronizar modelos tridimensionais in vitro de melanoma humano em mono e cocultura com célula do sistema imunitário e avaliar o comportamento dos modelos na presença ou ausência de fármacos. Utilizamos 4 linhagens de melanoma humano (Sk-Mel 28, Sk-Mel 147, MeWo e CHL-1), cada uma representativa dos principais subgrupos da classificação genômica da doença (BRAF, NRAS, NF-1 e triplo negativo, respectivamente). Além dessas, foi utilizada também a linhagem THP-1 como modelo de macrófago humano. Foram testados três métodos para obtenção dos esferoides, hanging drop, matriz de baixa adesão e sensibilização de placa. Foi possível obter esferoides de monocultura e cocultura de todas as células. Utilizando cultivo bidimensional para cada linhagem, foi determinado o valor de concentração inibitória média (IC50) para dois fármacosreferência utilizados na terapia-alvo: vemurafenib, que atua como inibidor competitivo da proteína BRAF mutada, e cobimetinib, que atua inibindo a atividade da proteína MEK1/2. Na sequência, os esferoides foram expostos à 3 concentrações dos fármacos e os parâmetros de tamanho, viabilidade e morte celular foram avaliados. Os esferoides derivados da linhagem de célula Sk-Mel 28, que possui mutação em BRAF foram mais sensíveis a ambos conforme esperado, sendo observada diminuição no tamanho dos esferoides. Ao marcar os esferoides com iodeto de propídio foi possível avaliar ainda que essa redução não ocorreu por processo de morte celular e sim, provavelmente, por interferência no processo de divisão das células. Comparando-se os resultados obtidos entre os modelos de mono e cocultura, observou-se que os esferoides em cocultura tendem a ser mais resistentes que aqueles em monocultura, uma vez que eles possuem tamanho mais próximo aos do controle, evidenciando o papel do macrófago na resistência tumoral. Dessa forma este trabalho traz a padronização de obtenção de modelo tridimensional de células de melanoma com diferentes perfis genéticos, com ou sem células do sistema imune, que são responsivos a fármacos e que podem ser utilizados na prospecção de novas drogas. Ainda, este trabalho pode ser utilizado como um passo inicial para a adoção de métodos de obtenção de estruturas tridimensionais ex vivo, utilizando tecido tumoral derivado de pacientes contendo perfis genéticos semelhantes aos testados.Abstract: Three-dimensional models are vastly used and can represent the in vivo tissue architecture and cell behavior. Models with tumor cells can mimic many in vivo characteristics such as those related to tumor microenvironment. The tumor microenvironment also presents non-tumor cells, especially macrophages, which can be three-dimensionally co-cultured with tumor cells, creating a drug discovery test platform, for instance. Therefore, this work aims to obtain and standardize in vitro three-dimensional models of human melanoma and immune system cells lines and evaluate these models behavior in the presence or absence of drugs. Four human melanoma cell lines (Sk-Mel 28, Sk-Mel 147, MeWo and CHL-1), each representative of the disease main genomic classification subgroups (BRAF, NRAS, NF-1, and triple negative, respectively). In addition, the THP-1 cell line was used as a model of human macrophage. Three methods were evaluated to obtain cell spheroids: hanging drop, low adhesion matrix and plate sensibilization. It was possible to obtain monoculture and coculture spheroids from all cells. Two-dimensional culture of each melanoma cell line was used to determine the mean inhibitory concentration value (IC50) of two reference drugs used in targeted therapy: vemurafenib, which inhibits the BRAF mutated protein, and cobimetinib, which inhibits MEK1/2 protein activity. Subsequently, the spheroids were exposed to three drug concentrations and the parameters of size, viability, and cell death were evaluated. The spheroids derived from Sk-Mel 28 cell line, which are BRAF mutated, were more sensitive to both drugs, as expected, with a decreased spheroids size. Spheroids stained with propidium iodide showed low levels of fluorescence, indicating that the decrease in size occurred due to cell division/cell cycle arrest and not to cell death. Comparing mono and coculture models, spheroids in coculture tend to be more resistant than those in monoculture, considering its equivalent size compared to control, evidencing the macrophage role in tumor resistance. Hence, this work provides standards for obtaining three-dimensional models of melanoma tumor cells bearing different genetic profiles, including or not immune system cells, which are responsive to drugs and that could be useful to new drugs prospection. Furthermore, this work can be used as an initial step in the adoption of methods to obtain ex vivo three-dimensional structures derived from patient's tissue bearing genetic profiles like those tested