Systems analysis reveals a transcriptional reversal of the mesenchymal phenotype induced by SNAIL-inhibitor GN-25

Abstract Background HMLEs (HMLE-SNAIL and Kras-HMLE, Kras-HMLE-SNAIL pairs) serve as excellent model system to interrogate the effect of SNAIL targeted agents that reverse epithelial-to-mesenchymal transition (EMT). We had earlier developed a SNAIL-p53 interaction inhibitor (GN-25) that was shown to suppress SNAIL function. In this report, using systems biology and pathway network analysis, we show that GN-25 could cause reversal of EMT leading to mesenchymal-to-epithelial transition (MET) in a well-recognized HMLE-SNAIL and Kras-HMLE-SNAIL models. Results GN-25 induced MET was found to be consistent with growth inhibition, suppression of spheroid forming capacity and induction of apoptosis. Pathway network analysis of mRNA expression using microarrays from GN-25 treated Kras-HMLE-SNAIL cells showed an orchestrated global re-organization of EMT network genes. The expression signatures were validated at the protein level (down-regulation of mesenchymal markers such as TWIST1 and TWIST2 that was concurrent with up-regulation of epithelial marker E-Cadherin), and RNAi studies validated SNAIL dependent mechanism of action of the drug. Most importantly, GN-25 modulated many major transcription factors (TFs) such as inhibition of oncogenic TFs Myc, TBX2, NR3C1 and led to enhancement in the expression of tumor suppressor TFs such as SMAD7, DD1T3, CEBPA, HOXA5, TFEB, IRF1, IRF7 and XBP1, resulting in MET as well as cell death. Conclusions Our systems and network investigations provide convincing pre-clinical evidence in support of the clinical application of GN-25 for the reversal of EMT and thereby reducing cancer cell aggressiveness

Mesenchymal to amoeboid transition is associated with stem-like features of melanoma cells

Background: Cellular plasticity confers cancer cells the ability to adapt to microenvironmental changes, a fundamental requirement for tumour progression and metastasis. The epithelial to mesenchymal transition (EMT) is a transcriptional programme associated with increased cell motility and stemness. Besides EMT, the mesenchymal to amoeboid transition (MAT) has been described during tumour progression but to date, little is known about its transcriptional control and involvement in stemness. The aim of this manuscript is to investigate (i) the transcriptional profile associated with the MAT programme and (ii) to study whether MAT acquisition in melanoma cancer cells correlates with clonogenic potential to promote tumour growth. Results: By using a multidisciplinary approach, we identified four different treatments able to induce MAT in melanoma cells: EphA2 overexpression, Rac1 functional inhibition using its RacN17 dominant negative mutant, stimulation with Ilomastat or treatment with the RhoA activator Calpeptin. First, gene expression profiling identified the transcriptional pathways associated with MAT, independently of the stimulus that induces the MAT programme. Notably, gene sets associated with the repression of mesenchymal traits, decrease in the secretion of extracellular matrix components as well as increase of cellular stemness positively correlate with MAT. Second, the link between MAT and stemness has been investigated in vitro by analysing stemness markers and clonogenic potential of melanoma cells undergoing MAT. Finally, the link between MAT inducing treatments and tumour initiating capability has been validated in vivo. Conclusion: Taken together, our results demonstrate that MAT programme in melanoma is characterised by increased stemness and clonogenic features of cancer cells, thus sustaining tumour progression. Furthermore, these data suggest that stemness is not an exclusive feature of cells undergoing EMT, but more generally is associated with an increase in cellular plasticity of cancer cells

Einfluss des Transkriptionsfaktors Snail in der Initiation und Progression von PanINs beim invasiven duktalen Pankreaskarzinom im transgenen Tumormausmodell

Das duktale Adenokarzinom des Pankreas rangiert in Deutschland an vierter Stelle der Krebstodesursachen. Die relative Fünf-Jahres-Überlebensrate liegt bei nur 8%. Ursächlich für die schlechte Prognose sind zum einen die späte Diagnosestellung aufgrund fehlender Früherkennungsmaßnahme und die aggressive Tumorbiologie. Dem invasiven Pankreaskarzinom gehen ähnlich wie bei der Adenom-Karzinom-Sequenz des kolorektalen Karzinoms Vorläuferläsionen (PanINs) voraus. Einhergehend mit diesen Vorläuferläsionen kommt zu einer Akkumulation von genetischen Veränderungen. Um die Krankheitsentwicklung besser zu verstehen gibt es verschiedene Mausmodelle, welche die humanen Karzinogenese rekapitulieren. In dieser Arbeit haben wir das bereits in vielen Studien erprobte Mausmodell von David Tuveson mit Snail-Knock-Out-Mäusen gekreuzt und so Snaildel1;Pdx-1-Cre;LSL-KrasG12D/+-Mäuse erschaffen. Ziel war es so den Einfluss des Transkriptionsfaktor Snail1 auf die Entwicklung von PanIN-Läsionen zu untersuchen. Snail1 ist ein Schlüsselprotein der EMT (Epithelialen-Mesenchymalen Transition und wirkt als direkter Repressor von E-Cadherin, einem Zelladhäsionsmolekül. Die EMT ist ein Zellprogramm welches sessilen epithelialen Zellen erlaubt mesen-chymale Eigenschaften, wie Motilität und Invasivität, zu erlangen. Homo- und heterozygote Snaildel1;Pdx-1-Cre;LSL-KrasG12D/+-Mäuse wurden in 6 Beobachtungsräume eingeteilt (2,4,6,8,10 u. 12 Mon.) und im Anschluss das Pankreas histopathologisch und immunhistochemisch untersucht. Weiterhin wurden mittels qRT-PCR die Pankreata auf ihren Gehalt an Snail1, Twist1, CDH1/E-Cadherin und Sox-9 mRNA auf Transkriptionsebene untersucht. Es zeigte sich eine signifikant später einsetzende Entwicklung sowie langsamere Progression von PanIN-Läsionen im Vergleich zu der Kontrollgruppe (Pdx-1-Cre; Kras). Snail1 war sowohl immunhistochemisch und auf Transkriptionse-bene signifikant vermindert exprimiert. Die E-Cadherin Expression zeigte heterogene Ergebnisse. In der Immunhistochemie fand sich in den Snaildel1;Pdx-1-Cre;LSL-KrasG12D/+-Mäusen eine etwas stärkere Positivität, in der qRT-PCR eine heterogene Expression. Zum größten Teil war die Expression jedoch erniedrigt. Weiterhin zeigte sich eine deutlich verminderte Expression der Transkriptionsfaktoren Sox9 und Twist1. Für MMP 7 konnte ebenfalls eine geringere Expression in der immunhistochemischen Färbung nachgewiesen werden. Erstmals konnte mit dieser Arbeit in vivo nachgewiesen werden, dass unter Abwesenheit von Snail1 die Initiation und Progression von PanINs drastisch verlangsamt wird. Die klinische Relevanz von Snail1 entweder als Biomarker in der Früherkennung oder als therapeutisches Target sollte anhand weiterer Studien untersucht werden