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Développement d'une plateforme pour l'analyse sur puce d'un biomarqueur par couplage des technologies de résonance des plasmons de surface et de spectrométrie de masse
The analytic approach of interrogation on chip by mass spectrometry is a suitable technique tomultiplexed analysis required for biomarker research in modern diagnosis. The aim was to contributeto the technological and methodological developments of analysis platform called SUPRA-MS(Surface Plasmon Resonance in Array coupled to Mass Spectrometry) whose goal is to provideadditional data to assay on the target protein by mass spectrometry. At first, gold chips compatiblewith SPRi and MS were designed and fabricated using vacuum deposition techniques. An originalstudy coupling SPRi with AFM has established a relationship between the SPR signal measured andthe real amount of proteins bound to nanostructured chips. We developed an immobilization procedurein array format (spots 16-96) by covalent monolayer of specific antibodies directed against the proteinLAG3, a biomarker of breast cancer for multiplex analysis of human biological samples (plasma).Human plasma containing 300 ng/mL of LAG3 is injected to the chip surface. The injection ismonitored in real time by SPRi and leads to the biomarker capture at the femtomole scale. After thebiosensing step, a collective treatment of spots by spray for in situ protein digestion and matrixdeposition in view of a MS analysis was developed by Dr. Patrick Ducoroy's team (CLIPP-CHUDijon). The MS and MS-MS analysis by MALDI-TOF was developed to analyze all spotsautomatically and determine their peptide mapping leading to 100% of the biomarker identification.This technology does not require the use of specific markers, is suitable to the biomarkerscharacterization and discrimination of protein variants.Lâapproche analytique dâinterrogation sur puce par spectromĂ©trie de masse est une techniqueparticuliĂšrement bien adaptĂ©e Ă lâanalyse multiplexĂ©e requise pour la recherche de biomarqueurs dansle diagnostic moderne. Lâobjectif a Ă©tĂ© de contribuer aux dĂ©veloppements technologiques etmĂ©thodologiques dâune plateforme dâanalyse baptisĂ©e SUPRA-MS (Imagerie par RĂ©sonance desPlasmons de Surface en array combinĂ©e Ă la SpectromĂ©trie de Masse). Des puces dâor compatiblesavec la SPRi et la MS ont Ă©tĂ© conçues et rĂ©alisĂ©es Ă lâaide des techniques de dĂ©pĂŽt sous vide. UneĂ©tude originale couplant la SPRi avec lâAFM a permis dâĂ©tablir une relation entre le signal SPRmesurĂ© et la quantitĂ© rĂ©elle de protĂ©ines fixĂ©es sur des puces nanostructurĂ©es. Nous avons ensuitedĂ©veloppĂ© une procĂ©dure dâimmobilisation en format array (16 à λ6 spots) par liaison covalente enmonocouche des anticorps spĂ©cifiques, dirigĂ©s contre un biomarqueur du cancer du sein (LAG3) pourune analyse multiplexĂ©e dâĂ©chantillons biologiques. Du plasma humain contenant 300 ng/mL deLAGÎł est injectĂ© Ă la surface de la puce. Lâinjection est suivie en temps rĂ©el par SPRi et conduit Ă unecapture du biomarqueur Ă lâĂ©chelle de la femtomole par spots. Un traitement collectif des spots parspray pour la digestion in situ des protĂ©ines et le dĂ©pĂŽt de matrice en vue dâune interrogation MS enMALDI-TOF a Ă©tĂ© mis au point par lâĂ©quipe du Dr Patrick Ducoroy (CLIPP-CHU Dijon). LesrĂ©sultats MS obtenues ont permis 100 % dâidentification du biomarqueur. Cette technologie sansmarquages spĂ©cifiques est particuliĂšrement bien adaptĂ©e Ă la caractĂ©risation fine des biomarqueurs et Ă la discrimination de variants protĂ©iques