Simultaneous prediction of RNA secondary structure and helix coaxial stacking

BACKGROUND: RNA secondary structure plays a scaffolding role for RNA tertiary conformation. Accurate secondary structure prediction can not only identify double-stranded helices and single stranded-loops but also help provide information for potential tertiary interaction motifs critical to the 3D conformation. The average accuracy in ab initio prediction remains 70%; performance improvement has only been limited to short RNA sequences. The prediction of tertiary interaction motifs is difficult without multiple, related sequences that are usually not available. This paper presents research that aims to improve the secondary structure prediction performance and to develop a capability to predict coaxial stacking between helices. Coaxial stacking positions two helices on the same axis, a tertiary motif present in almost all junctions that account for a high percentage of RNA tertiary structures. RESULTS: This research identified energetic rules for coaxial stacks and geometric constraints on stack combinations, which were applied to developing an efficient dynamic programming application for simultaneous prediction of secondary structure and coaxial stacking. Results on a number of non-coding RNA data sets, of short and moderately long lengths, show a performance improvement (specially on tRNAs) for secondary structure prediction when compared with existing methods. The program also demonstrates a capability for prediction of coaxial stacking. CONCLUSIONS: The significant leap of performance on tRNAs demonstrated in this work suggests that a breakthrough to a higher performance in RNA secondary structure prediction may lie in understanding contributions from tertiary motifs critical to the structure, as such information can be used to constrain geometrically as well as energetically the space of RNA secondary structure

Simultaneous prediction of RNA secondary structure and helix coaxial stacking

Abstract Background RNA secondary structure plays a scaffolding role for RNA tertiary conformation. Accurate secondary structure prediction can not only identify double-stranded helices and single stranded-loops but also help provide information for potential tertiary interaction motifs critical to the 3D conformation. The average accuracy in ab initio prediction remains 70%; performance improvement has only been limited to short RNA sequences. The prediction of tertiary interaction motifs is difficult without multiple, related sequences that are usually not available. This paper presents research that aims to improve the secondary structure prediction performance and to develop a capability to predict coaxial stacking between helices. Coaxial stacking positions two helices on the same axis, a tertiary motif present in almost all junctions that account for a high percentage of RNA tertiary structures. Results This research identified energetic rules for coaxial stacks and geometric constraints on stack combinations, which were applied to developing an efficient dynamic programming application for simultaneous prediction of secondary structure and coaxial stacking. Results on a number of non-coding RNA data sets, of short and moderately long lengths, show a performance improvement (specially on tRNAs) for secondary structure prediction when compared with existing methods. The program also demonstrates a capability for prediction of coaxial stacking. Conclusions The significant leap of performance on tRNAs demonstrated in this work suggests that a breakthrough to a higher performance in RNA secondary structure prediction may lie in understanding contributions from tertiary motifs critical to the structure, as such information can be used to constrain geometrically as well as energetically the space of RNA secondary structure.</p

Engineering protein biosynthesis apparatus, advanced design and screening strategies for small and fluorinated substrates in orthogonal translation

Protein engineering is a comprehensive toolbox for the chemical modification of enzymes in particular, and for the expansion of molecular functional diversity in general. In recent decades, two different categories have become established for the engineering of proteins. These include the approach of directed evolution approaches on the one hand and the strategies of rational protein design on the other hand. In particular, the use of noncanonical amino acids to introduce new functionalities has gained importance in the engineers’ toolbox. These include isostructural analogues of canonical amino acids as well as molecules with reactivities that can provide sites for further protein modifications. In this study, we have presented a strategy for manipulating the protein biosynthesis machinery towards the incorporation of noncognate fluorinated substrates. In general, fluorinated amino acids are not genetically encoded. These mainly synthetic building block are valuable for the design of particularly stable protein folds and for targeting highly specific protein-protein interactions. Fluorine is small and has a very low polarizability and the strongest inductive effect among the chemical elements found on earth. Due to these unique stereoelectronic properties, fluorine substitution is advantageously used in protein and peptide design. In this context, the strategy of directed evolution was applied to construct isoleucyl-transfer ribonucleic acid synthetase libraries for the isoleucine AUA rare codon reassignment with small aliphatic fluorinated amino acids, such as L-trifluoroethylglycine, by random mutagenesis. A suitable screening plasmid containing a mutant of superfolder green fluorescent protein (sfGFP) as reporter protein and a modified isoleucine transfer ribonucleic acid (tRNA_UAU) from Escherichia coli was produced to create an enhanced molecular adaptor level for gene expression. However, the required selection strain could not be constructed by genome editing due to the complexity of essential gene modification. In the second part of the study, different reporter proteins were used in advanced design with noncanonical amino acids for improvement of their biophysical, chemical, and biological properties. A robust alkene-tagged sfGFP variant was obtained, which is a valuable target in medicinal chemistry. In addition, the residue-specific incorporation of proline analogues into green fluorescent protein (GFP) derivates ─ enhanced green fluorescent protein (EGFP), NowGFP, and KillerOrange ─ enables the study of the role of prolines in the typical β-barrel structure organization

Étude du ribozyme SOFA-HDV comme outil moléculaire : application et optimisation

Les avancées en biologie moléculaire et cellulaire des dernières décennies ont permis de redéfinir le rôle de l’ARN au sein des cellules de tous les domaines du vivant. Initialement cantonné dans un rôle de support transitoire de l’information génétique du génome (ADN) en direction des effecteurs ou molécules actives (protéines et métabolites), l’ARN est maintenant associé à toutes les sphères de la biologie. Les molécules d’ARN peuvent agir autant comme génome (virus), comme molécules adaptatrices (ARNt), comme messager de l’information génétique (ARNm), comme enzyme (ribozyme) ou encore comme molécules régulatrices en cis (riboswitch) ou en trans (miARN). Nous savons aussi que la grande majorité du génome des cellules eucaryotes est transcrite à un moment ou un autre. Ces implications de l’ARN en font une cible de choix pour la recherche en génomique fonctionnelle, ainsi que pour des applications thérapeutiques. C’est pourquoi, depuis la découverte des ARN catalytiques et de l’interférence à l’ARN, beaucoup d’efforts ont été consacrés pour développer un éventail d’outils moléculaires permettant d’inhiber l’expression de gènes d’intérêt. Le défi qui se dessine aujourd’hui est le développement d’outils plus spécifiques et plus efficaces, entre autres parce que la variété d’ARN qu’un inhibiteur peut rencontrer est beaucoup plus grande qu’initialement estimée. De plus, les données recueillies lors d’essais cliniques montrent la nécessité de combiner un très grand potentiel avec une spécificité accrue. Les travaux de cette thèse se concentrent sur un outil moléculaire qui a le potentiel de répondre positivement à ce défi : le ribozyme SOFA-HDV. Mon projet de recherche visait à démontrer le potentiel de cet ARN catalytique pour le ciblage de gènes in cellulo et de développer son application. Tout d’abord, j’ai démontré que le ribozyme SOFA-HDV pouvait être utilisé pour inhiber la fonction d’un ARN in cellulo. Cette étude a également mis en évidence l’usage de ce ribozyme comme agent antiviral, avec le virus de l’hépatite C comme modèle. Le développement de nouvelles thérapies plus performantes avec peu d’effets secondaires demeure un enjeu important. Au moment de publier ces travaux, en plus d’être le premier exemple exhaustif de l’utilisation du ribozyme SOFA-HDV in cellulo, notre étude contenait le plus grand nombre de ribozymes jamais testés contre le VHC en une seule publication. Bien que modeste, l’effet observé démontre que ce ribozyme peut inhiber la réplication d’un virus dans un modèle in cellulo. Nos résultats exposent aussi la différence d’accessibilité entre les ARN de polarités positive et négative du VHC in cellulo. Par la suite, j’ai participé au développement de ribozymes SOFA-HDV ciblant le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) dans le cadre d’une collaboration. Parmi les ribozymes testés, nous en avons identifié un dont l’activité catalytique réduit la réplication du VIH de plus de 50 % dans un modèle cellulaire. Dans le cadre de cette étude, nous avons identifié un site hautement favorable pour le ciblage par un ribozyme SOFA-HDV ou par un shARN. Des données suggèrent aussi une spécificité élevée du ribozyme SOFA-HDV. Des tests d’inhibition avec différentes souches du VIH montrent que l’activité du ribozyme est affectée avec un seul mésappariement entre le biosenseur (élément du module SOFA resposable de reconnaissance du substrat) et son site de liaison. Finalement, dans un esprit d’intégration des connaissances recueillies au fil des différents projets impliquant le ribozyme SOFA-HDV, je me suis intéressé à leur processus de sélection pour le ciblage génique. J’ai démontré l’impact de la séquence du biosenseur sur l’activité du ribozyme. J’ai également illustré l’autocoupure possible lorsque la séquence du biosenseur crée un prolongement du bloqueur (élément du module SOFA agissant comme verrou) ainsi que l’impact de la structure du substrat autant au niveau des sites de liaison du domaine de reconnaissance que du biosenseur. Ces nouveaux éléments combinés aux données antérieures sur le ribozyme HDV original m’ont permis d’élaborer une marche à suivre pour la présélection des ribozymes SOFA-HDV selon leur potentiel comme ciseaux moléculaires. En conclusion, ces travaux ont contribué à mettre de l’avant le potentiel du ribozyme SOFA-HDV pour des applications de ciblage de gènes, plus particulièrement pour des cibles virales. De ce fait, il existe maintenant des exemples concrets de l’utilisation de ce ribozyme en cellules humaines. Tout indique que la spécificité du module SOFA est préservée in cellulo et serait avantageusement comparable à d’autres technologies. Globalement, cette thèse devrait rendre l’utilisation du ribozyme SOFA-HDV plus accessible et favoriser son développement comme outil moléculaire