An objective reduction technique of proteomic mass spectra based on multi-scale fuzzy thresholding

A proteomic approach offers a powerful and complementary tool to genomics. It allows to index and characterize proteins, and, for example, to compare their levels of expression between healthy and pathological states. Proteomic analyses are mainly based on the separation of proteins by two-dimensional gel electrophoresis and their subsequent identification by comparing the data from Mass Spectrometry (SM) analyses to the theoretical ones contained in databases. In mass spectrometry, the detector noise, the electronic and chemical noise, sometimes the small amount of peptides that has to be treated and finally the spectrum reduction noise (due to bad filtering and/or thresholding), can induce Parasitic Mass Peaks (PMP) and/or hide some Useful Mass Peaks (UMP) of low intensities. The immediate consequence is that the presence of the PMP and the absence of the UMP will be detrimental to the protein identification quality. In this article, we propose an original algorithm eliminating the PMP, detecting and amplifying those which are useful. The preprocessing principle uses a multi-scale analysis technique coupled to a fuzzy thresholding (multi-scale fuzzy thresholding), a local amplification of the UMP, and finally an adaptive Base Line Correction. The associated frequencies with the PMP are distributed on all the spectrum pass bandwidth. This leads us to a dyadic tree structure subband decomposition. The algorithm principle consists of dividing the frequential pass bandwidth of each masses spectrum into two subbands, a Low and High Frequency (LF,HF) subband, then each subband is in turn divided into two subbands etc. The HF subbands are then thresholded according to the minimization criterion of the Shannon fuzzy entropy, and then amplified locally; the base line is calculated in an adaptive way and subtracted from reconstructed spectrum. To evaluate the quality of this algorithm, we present a comparison of the results obtained by our algorithm, and those obtained by the DataExplorer software. The latter is a reduction software provided within the MALDI-TOF spectrometer software package.La protéomique offre une approche puissante et complémentaire à la génomique. Elle permet de répertorier et caractériser les protéines, de comparer leur niveau d’expression entre un état physiologique sain et malade par exemple. L’analyse protéomique se fait essentiellement par l’utilisation de la technique d’électrophorèse bidimensionnelle couplée à la technique d’analyse par Spectrométrie de Masse (SM). La première, aidée par l’imagerie protéomique, conduit à la localisation des protéines candidates à une analyse par SM. La comparaison des spectres de masses obtenus à des bases de données protéiques, conduit à l’identification des protéines d’intérêt en terme de peptides. Le problème qui se pose souvent est que les spectres sont bruités et pauvres en masses. En effet, le bruit du détecteur, le bruit électronique et chimique, la présence de peu de matériel protéique et enfin le bruit de la réduction des spectres (mauvais filtrage et/ou seuillage), tous ces bruits peuvent induire des Pics de Masses Parasites (PMP) et/ou supprimer des Pics de Masses Utiles (PMU) de faible intensité. La conséquence immédiate est que la présence des PMP et l’absence des PMU seront utilisées au dépens de la qualité d’identification de la protéine. Dans cet article, nous proposons un algorithme original éliminant les PMP, détectant et amplifiant ceux utiles. Le principe du pré-traitement utilise une Analyse Multirésolution (AM) couplée à un seuillage basé sur la logique floue (seuillage flou multi-échelle), une amplification locale des PMU, et enfin une correction adaptative de la Ligne de Base (LB). Les fréquences associées aux PMP sont réparties sur toute la bande passante du spectre, ce qui nous conduit à une AM dite en arbre. Le principe consiste à découper la bande passante fréquentielle de chaque spectre de masses en deux sous-bandes, une Basse Fréquence (BF), l’autre Haute Fréquence (HF), ensuite chaque sous-bande est à son tour découpée en deux sous-bandes etc. Les sous-bandes HF sont seuillées selon le critère de minimisation de l’entropie floue de Shannon et amplifiées localement, la ligne de base est calculée automatiquement et soustraite du spectre reconstruit. Pour évaluer la qualité de cet algorithme, nous présentons une comparaison des résultats obtenus par notre algorithme, et ceux fournis par le spectromètre MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation-Time Of Flight), qui utilise le logiciel « DataExplorer » comme logiciel de réduction

Implication de HMGB1 dans la différentiation des trophoblastes

Le placenta est l'organe essentiel au succès de la grossesse et la différenciation des trophoblastes est fondamentale pour son bon fonctionnement. La présence d’une inflammation non contrôlée, habituellement induite par des médiateurs inflammatoires endogènes, est associée à plusieurs complications de la grossesse. High Mobility Group Box 1 (HMGB1), une protéine nucléaire qui peut avoir des actions inflammatoires lorsque secrétée dans le milieu extracellulaire, est un des médiateurs inflammatoires endogènes augmentés lors des grossesses pathologiques. Cependant, la manière dont HMGB1 agit à l’interface materno-foetale est encore inconnue. Ce travail de maîtrise a comme objectifs d’évaluer la concentration, la localisation subcellulaire et la sécrétion de HMGB1 lors de la différentiation des trophoblastes et d’étudier sa distribution dans le placenta de grossesses compliquées par une préeclampsie (PE). Dans ces travaux, nous avons démontré une augmentation de la concentration nucléaire de HMGB1 lors de la différenciation spontanée des trophoblastes. De plus, l’utilisation d’un inhibiteur d’histones déacétylases (c.-à-d. NaB) mène à une accumulation de HMGB1 dans le cytoplasme et favorise la différenciation, tandis que l’utilisation d’un inhibiteur de l’export nucléaire (c.-à-d. leptomycine) mène à une diminution de la différenciation. En ce qui concerne les grossesses compliquées par la PE, il y a une redistribution de HMGB1 avec une accumulation cytoplasmique. En conclusion, ces travaux démontrent l’association entre la modulation de HMGB1 et la différentiation des trophoblastes, bien que le lien causal reste à déterminer.The placenta plays a crucial role during pregnancy and trophoblast differentiation is fundamental to its proper functioning. The absence of inflammation is also essential for the success of gestation, the presence of uncontrolled inflammation is associated with several pregnancy complications, such as preeclampsia (PE) and preterm delivery. High Mobility Group Box 1 (HMGB1), a nuclear protein that acts as a pro-inflammatory mediator when secreted into the extracellular media, is one of the endogenous inflammatory mediators increased during pathological pregnancies. However, the actions of HMGB1 at the materno-fetal interface are still unknown. The aim of this work was to evaluate the concentration, subcellular localization and secretion of HMGB1 during trophoblast differentiation and to evaluate the distribution of HMGB1 in the placenta from pregnancies complicated with PE. In my studies I have shown an increase of HMGB1’s nuclear concentration during the spontaneous differentiation of trophoblasts. Moreover, the use of a histone deacetylase inhibitor (i.e. NaB) leads to an accumulation of HMGB1 in the cytoplasm and promotes differentiation, while the use of a nuclear export inhibitor (i.e. leptomycin) leads to a decrease in differentiation. Concerning pregnancies complicated with PE, there is a redistribution of HMGB1 with cytoplasmic accumulation. In conclusion, this work demonstrates the association between the modulation of HMGB1 localisation with trophoblasts differentiation, although the causal link remains to be determined

The regulation and induction of clathrin-mediated endocytosis through a protein aqueous-aqueous phase separation mechanism

La morphologie des cellules et leurs interactions avec l’environnement découlent de divers procédés mécaniques qui contribuent à la richesse et à la diversité de la vie qui nous entoure. À titre d’exemple, les cellules mammifères se conforment à différentes géométries en fonction de l’architecture de leur cytosquelette tandis que les bactéries et les levures adoptent une forme circulaire par turgescence. Je présente, dans cette thèse, la découverte d’un mécanisme de morphogénèse supplémentaire, soit la déformation de surface cellulaire via l’assemblage de protéines par démixtion de phases aqueuses non miscibles et l’adhésion entre les matériaux biologiques. J’expose de façon spécifique comment ce mécanisme régule le recrutement et le mouvement dynamique des protéines qui induisent l’invagination de la membrane plasmique lors de l’endocytose clathrine-dépendante (CME). Le phénomène de démixtion des protéines dans le cytoplasme est analogue à la séparation de phase de l’huile en solution aqueuse. Il constitue un mécanisme cellulaire important et conservé, où les protéines s’agglomèrent grâce aux interactions intermoléculaires qui supplantent la tendance du système à former un mélange homogène. Plusieurs exemples de compartiments cellulaires dépourvus de membrane se forment par démixtion de phase, tels que le nucléole et les granules de traitement de l’ARN [1-6]. Ces organes ou compartiments dénommés NMO, du terme anglais « non-membranous organelles », occupent des fonctions de stockage, de traitement et de modification chimique des molécules dans la cellule. J’explore ici les questions suivantes : est-ce que les NMO occupent d’autres fonctions à caractère morphologique ? Quels signaux cellulaires régulent la démixtion de phase des protéines dans la formation des NMO ? Fondée sur la physique mécanique du contact entre les matériaux, j’émets l’hypothèse que des compartiments cellulaires nanoscopiques, formés par démixtion de phase, génèrent des forces mécaniques par adhésion interfaciale. Le travail mécanique ainsi obtenu déforme le milieu cellulaire et les surfaces membranaires adjacents au NMO nouvellement créé. Le but de mon doctorat est de comprendre comment les cellules orchestrent, dans le temps et l’espace, la formation des NMO associés au CME et comment ceux-ci génèrent des forces mécaniques. Mes travaux se concentrent sur les mécanismes de démixtion de phase et d’adhésion de contact dans le processus d’endocytose chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Pour enquêter sur le rôle des modifications post-traductionnelles dans ces mécanismes, nous avons premièrement analysé la cinétique de phosphorylation des protéines en conditions de stress. Mes résultats démontrent que le recrutement et la fonction de certaines protéines impliquées dans le CME se régulent via des mécanismes de phosphorylation. Outre les processus de contrôle post-traductionnel, nous avons élucidé le rôle des domaines de faible complexité dans l’assemblage de plusieurs protéines associées avec le CME. De concert avec les modifications de phosphorylation, des domaines d’interaction protéine-protéine de type PrD (du terme « prion-like domains ») modulent directement le recrutement des protéines au sein des NMO associés au CME. La nature intrinsèquement désordonnée de ces PrD favorise un mécanisme d’assemblage des protéines par démixtion de phase tel que postulé. Finalement, mes travaux confirment que la formation de ces NMO spécifiques génère des forces mécaniques qui déforment la membrane plasmique et assurent le processus de CME. D’un point de vue fondamental, mes recherches permettent de mieux comprendre l’évolution d’une stratégie cellulaire pour assembler des compartiments cellulaires sans membrane et pour fixer les dimensions biologiques associées au CME. De manière plus appliquée, cette étude a le potentiel de générer des retombées importantes dans la compréhension et le traitement de maladies neurodégénératives souvent associées à une séparation de phase aberrante et à la formation d’agrégats protéiques liés à la pathologie.Evolution has resulted in distinct mechanical processes that determine the shapes of living cells and their interactions with each other and with the environment. These molecular mechanisms have contributed to the wide variety of life we observe today. For example, mammalian cells rely on a complex cytoskeleton to adapt specific shapes whereas bacteria, yeast and plants use a combination of turgor pressure and cell walls to have their characteristic bloated form. In this dissertation, I describe my discovery of an unforeseen additional mechanism of morphogenesis: protein aqueous-aqueous phase separation and adhesive contact between biomaterials as a simple and efficient ways for cells to organize internal matter and accomplish work to shape internal structures and surfaces. I specifically describe how a fundamental process of phospholipid membrane and membrane-embedded protein recycling, clathrin-mediated endocytosis (CME), is driven by this mechanism. Analogous to water and oil emulsions, proteins, and biopolymers in general, can phase separate from single to a binary aqueous phase. For proteins that de-mix from the bulk environment, the intermolecular interactions (or cohesive energy) that favors protein condensation only needs to overcome the low mixing entropy of the system and represents a conserved and energy efficient cellular strategy [2, 3, 7, 8]. So far, various examples of phase separated cellular compartments, termed non-membranous organelles (NMOs), have been discovered. These include the nucleoli, germ line P granules and P bodies, to name a few [1-6]. NMOs are involved in many conserved biological processes and can function as storage, bioreactor or signaling bodies. Cells use phase separation as a scheme to organize internal matter, but do NMOs occupy other complex functions, such as morphogenesis? What specific signals trigger protein phase separation? Based on mechanical contact theory, I proposed that hundreds of nanometer- to micron-scale phase separated bodies can deform the cellular environment, both cytoplasm and membranes, through interfacial adhesion. I studied how mechanical contact between a phase-separated protein fluid droplet and CME nucleation sites on membranes drive endocytosis in the model organism budding yeast, Saccharomyces cerevisiae. Specifically, this dissertation describes first, my investigations of post-translational modifications (phosphorylation) of several CME-mediating proteins and the implications of these modifications in regulating CME. I then describe how my efforts to understand what was distinct about the proteins that are phosphorylated led me to propose their phase separation into droplets capable of driving invagination and vesicle formation from plasma membrane. I used fluorescence microscopy, mass spectrometry and micro rheology techniques to respectively determine the spatiotemporal dynamics, phosphorylation modifications and material properties of coalesced CME-mediating proteins. I further investigated how phase separation of these proteins might generate mechanical force. I demonstrate that changes in the phosphorylation of some endocytic proteins regulates their recruitment to CME nucleation sites. We achieved reliable predictions of functional phosphosites by combining information on the conservation of the post-translational modifications with analysis of the proportion of a protein that is dynamically phosphorylated with time. The same dynamically phosphorylated proteins were enriched for low amino acid compositional complexity “prion-like domains”, which we demonstrated were essential to these proteins undergoing aqueous-aqueous phase separation on CME nucleation sites. I then demonstrate how phase separated droplet can produce mechanical work to invaginate membranes and drive CME to completion. In summary, I have discovered a fundamental molecular mechanism by which phase separated biopolymers and membranes could apply work to shape each other. This mechanism determines the natural selection of spatial scale and material properties of CME. Finally, I discuss broader implications of this dissertation to mechanistic understandings of the origins of neurodegenerative diseases, which likely involve pathological forms of protein phase separation and/or aggregation

Étude des propriétés gélifiantes et viscosifiantes de systèmes mixtes isolat de protéines de lactosérum-polysaccharides en conditions associatives

Les interactions entre protéines et polysaccharides dépendent des conditions environnementales et de leurs propriétés intrinsèques. La cosolubilité, la complexation et l’incompatibilité en sont le résultat. La complexation et l’incompatibilité ont démontré une amélioration des propriétés fonctionnelles de systèmes mixtes comparativement aux biopolymères pris individuellement. L’incompatibilité étant souvent la règle, cette recherche a pour but d’approfondir les connaissances sur les propriétés fonctionnelles des systèmes mixtes protéines-polysaccharides en conditions de compatibilité ou d’interactions associatives et de caractériser les nouvelles fonctionnalités qui en découlent. Un premier système isolat de protéines de lactosérum-xanthane a été étudié pour ses aptitudes à la gélification en conditions de compatibilité induites suite à une variation de pH et du ratio protéines-polysaccharides. Suivant l’application d’un traitement thermique, la solution est passée de compatible à incompatible. Les gels démontraient une augmentation du module élastique (G’) due à l’incompatibilité telle qu’observée par microscopie confocale à balayage laser. L’ajout de NaCl a augmenté cette incompatibilité et l’a rendue excessive au-delà d’une concentration critique entraînant une chute du G’. La compatibilité a ensuite été étudiée sur un système isolat de protéines de lactosérum-pectine. Suite à une variation de pH, de la concentration en biopolymères et du ratio protéines-polysaccharides, des conditions de compatibilité ont été confirmées par les mesures d’absorbance et du nombre de charges. Cette compatibilité a mené à une diminution de la viscosité en solution diluée due à la formation de complexes solubles alors qu’en solution concentrée, la complexation l’a plutôt augmentée. Un système modèle de yogourt ferme a finalement été étudié suite à l’incorporation de isolat de protéines de lactosérum et de pectine préalablement complexés et stabilisés. Les concentrations en protéines et en solides totaux ont été maintenues constantes. Les mélanges laitiers ont été acidifiés au glucono-delta-lactone. Les résultats démontrent que l’incorporation de complexes à différentes concentrations entrave la formation d’un réseau protéique homogène provoquant une diminution de la fermeté du gel et une augmentation de la synérèse. Les observations microscopiques appuient ces résultats. Les solutions mixtes permettent de développer de nouvelles propriétés fonctionnelles. Cependant, une meilleure connaissance de ces mélanges est nécessaire pour en arriver à des propriétés fonctionnelles variées et précises dans les formulations alimentaires.Protein polysaccharide interactions depend on both environmental conditions and intrinsic properties. Results are co-solubility, complexation and incompatibility. Complexation and incompatibility have demonstrated improvement of functional properties of mixed systems compared to those of the individual components. Incompatibility being the rule, the aim of this study is to widen knowledge on functional properties of mixed protein-polysaccharide systems in presence of compatibility or associative interactions and to characterise the new emerging functional properties. A first mixed system of whey protein isolate-xanthan has been studied for its gelling abilities following pH and protein-polysaccharide ratio variations. Following application of a thermal treatment, the solution passed from compatible to incompatible. Gelation was demonstrated by an increase in elastic modulus (G’) due to incompatibility as observed by confocal laser scanning microscopy. Addition of NaCl increased this incompatibility and made it excessive at a certain critical concentration leading to loss in G’. Compatibility has then been studied on a whey protein isolate-pectin system. Varying pH, biopolymer total concentration and protein-polysaccharide ratio allowed soluble complex formation which was confirmed with the measurement of absorbance and the number of charge. This compatibility led to a decrease in viscosity in diluted solution due to soluble complex formation while in concentrated solution, complexation rather increased it. A model system of firm yogurt was finally studied following incorporation of whey protein isolate and pectin first complexed and stabilised. Protein and total solid concentrations were kept constant. Milky solutions were acidified with glucono-delta-lactone. Results demonstrate that incorporation of complexes at different concentrations hampers the formation of a homogenous protein network provoking a decrease in gel stiffness and an increase in syneresis. Microscopic observations supported these conclusions. Mixed solutions prepared by carefully condunting complex formation allow the design of new functional properties. However, a better knowledge of these mixes is necessary in order to achieve varied and precise functional properties in food formulation

Compréhension du rôle structural d'exopolysaccharides de bactéries lactiques dans des systèmes laitiers fermentés enrichis en amidon modifié

Au Canada, l’utilisation d’amidon modifié dans le yogourt est usuel afin d’éviter des défauts de qualité comme la synérèse. Malgré cet ajout, les défauts demeurent. Les exopolysaccharides (EPS) produits naturellement par certaines bactéries lactiques suscitent un intérêt technologique dus à leur capacité de rétention d’eau et à moduler la viscosité. La structure des EPS et leurs interactions avec les protéines seraient responsables de ces effets plutôt que de la concentration produite. Jusqu’à présent, aucune étude n’a été réalisée sur l’utilisation conjointe d’amidon modifié et d’EPS dans les yogourts. Le but de ce travail était d’étudier le rôle structural des EPS produits in situ par certaines bactéries lactiques sur les propriétés rhéologiques/physiques (formation de gel, fermeté, viscosité, synérèse) et la microstructure de systèmes laitiers avec amidon modifié. Quatre ferments constitués chacun d’une souche de Streptococcus thermophilus et d’une souche de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, produisant des EPS aux caractéristiques structurales connues, ont été utilisés: HC15/210R (contrôle), HC15/291 (EPS neutre, rigide, peu ramifié), HC15/702074 (EPS neutre, flexible, hautement ramifié), 2104/210R (EPS chargé, rigide, linéaire). Le pH final de 4.6 a été atteint pour tous les ferments après 180-210 minutes à 42 C. Le processus de formation de gel n’a pas été influencé par la présence d’EPS. La comparaison de plusieurs EPS aux structures connues a permis d’établir que l’EPS chargé du ferment 2104/210R améliorait la fermeté en plus de contribuer à la viscosité. L’EPS neutre, rigide et peu ramifié du ferment HC15/291 améliorait significativement la viscosité et la rétention du sérum comparativement à l’EPS neutre, hautement ramifié et flexible du ferment HC15/702074. Malgré que le lissage ait diminué significativement les propriétés rhéologiques/physiques des systèmes laitiers, la fonctionnalité des EPS est maintenue. L’ajout d’amidon modifié a amélioré les propriétés rhéologiques/physiques des systèmes laitiers brassés tandis que peu d’effets ont été observés pour les systèmes laitiers fermes. Finalement, ce travail a démontré qu’il est possible d’améliorer les propriétés rhéologiques/physiques de systèmes laitiers par l’utilisation conjointe d’EPS aux caractéristiques structurales spécifiques et d’amidon modifié.In Canada, modified starch addition in yoghurt is frequent in order to limit technological defects such as syneresis. Despite the addition of modified starch, technological defects still occur. Exopolysaccharides (EPS) produced naturally by some lactic acid bacteria can be used as stabilizers in yoghurt. Literature indicates that their properties to bind water and to modulate viscosity are not correlated to EPS concentration but to their structure and interactions with milk proteins. To our knowledge, this is the first work that has studied the effect of combined use of modified starch and EPS in yoghurt. The aim of this work was to study the structure-function relationship of EPS produced in situ by lactic acid bacteria on the rheological/physical properties (gel formation, viscosity, firmness, stiffness) and the microstructure of fermented dairy systems with modified starch. Four starters composed of one strain of Streptococcus thermophilus and one strain of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and producing EPS with known structure were studied: HC15/210R (control), HC15/291 (neutral, stiff, few branched EPS), HC15/702074 (neutral, flexible, highly branched EPS) and 2104/210R (anionic, stiff, linear, EPS). A final pH of 4.6 was obtained after a fermentation of 180-210 minutes à 42 C for all starters. The gel formation process was not influenced by the presence of EPS. The comparison of several EPS of known structure has shown that the anionic EPS from 2104/210R starter improved firmness and viscosity. Neutral, stiff and few branched EPS from HC15/291 starter contributed to viscosity and limited syneresis comparatively to the neutral, flexible and highly branched EPS from HC15/702074 starter. Although the smoothing process had a negative impact on the values of all rheological/physical properties of fermented dairy systems, the functionality of EPS remained. The addition of modified starch improved the rheological/physical properties of stirred fermented dairy systems but had no effect on set fermented dairy systems. To conclude, this work has shown that the rheological/physical properties of fermented dairy systems may be improved by the combination of modified starch and EPS with specific structural characteristics

Caractérisation structurale et fonctionnelle d'AGP31, une glycoprotéine atypique de la paroi chez Arabidopsis thaliana

La paroi cellulaire végétale est une structure dynamique constituée de réseaux de polysaccharides et de protéines dont l'organisation supramoléculaire est complexe. AGP31, codée par At1g28290, a été identifiée comme une protéine multi-domaines abondante dans la paroi des cellules des hypocotyles étiolés d'Arabidopsis thaliana. Mon travail de thèse a consisté à élucider la structure et la fonction d'AGP31. La caractérisation structurale du domaine riche en Pro d'AGP31 a été effectuée : des résidus Hyp et des O-galactanes ont été localisés par spectrométrie de masse. AGP31 a été trouvée sous plusieurs glycoformes différant par le type et la taille des O-glycanes et/ou la longueur de la chaîne polypeptidique. Des tests in vitro ont montré des interactions entre différents domaines d'AGP31 et des polysaccharides pariétaux (HG méthylestérifiés, galactanes du RGI). Une remarquable affinité entre les O-galactanes d'AGP31 et la lectine PNA a été montrée, indiquant de possibles interactions avec des lectines pariétales. Le patron d'expression d'At1g28290 suggère un rôle de renforcement des parois lors de l'émergence de la radicule et de l'élongation rapide des hypocotyles étiolés. Cependant, l'étude de plantes ARNi sous-expresseurs et sur-expresseurs d'Atg28290 n'a pas permis de trouver un phénotype au cours du développement, probablement du fait d'une redondance fonctionnelle avec des gènes proches d'At1g28290. Ce travail constitue la première caractérisation structurale d'un domaine riche en Pro d'une protéine pariétale et permet de proposer qu'AGP31, via ses différents domaines, interagisse en réseau dans les parois avec elle-même, des polysaccharides ou des lectines.Plant cell wall is a dynamic structure consisting of polysaccharide and protein networks with a complex supramolecular organization. AGP31, encoded by At1g28290, was identified as a abundant multi-domain protein in Arabidopsis thaliana etiolated hypocotyls cell walls. My thesis project consisted in elucidating the structure and the function of AGP31. Structural characterization of the Pro rich domain was performed: Hyp residues and O-galactans were located using mass spectrometry. AGP31 was found as several glycoforms differing by the type and the size of O-glycans as well as by the polypeptidic length. In vitro assays showed interactions between AGP31 domains and cell wall polysaccharides (methylesterified HG, galactans from RGI). A remarkable affinity between AGP31 O-galactans and the PNA lectin was shown, indicating possible interactions with cell wall lectins. The expression pattern of At1128290 suggests a role in cell wall strengthening during radicle emergence and fast elongation of etiolated hypocotyls. However, study of RNAi underexpressors and overexpressors of At1g28290 did not permit to find a phenotype during development, probably because of functional redundancy with At1g28290 homologues. This work constitutes the first structural characterization of a Pro rich domain of a cell wall protein and permits to propose that AGP31, via its different domains, could make scaffolds in the cell wall through interactions with itself, polysaccharides and/or lectins

Recherche de la fonction de protéines riches en hydroxyproline dans les parois végétales

La paroi primaire végétale est une enveloppe dynamique impliquée dans le développement ainsi que la réponse aux contraintes environnementales. Elle est composée de réseaux de polysaccharides et de protéines dans lesquels interviennent des protéines multi-domaines de type LRX et des protéines à domaine PAC. Ce travail de thèse a consisté à rechercher la fonction de ces protéines dans les parois. Des analyses protéomiques réalisées sur des extraits de protéines pariétales de racines de plantes sauvages ou mutantes lrx1 d'A. thaliana ont permis d'identifier 424/434 protéines pariétales de plantes sauvages/lrx1 respectivement et 25 protéines candidates pouvant jouer un rôle dans la morphogenèse des poils absorbants. Par ailleurs, des protéines à domaine PAC ont été identifiées dans toutes les plantes terrestres étudiées. L'apparition des protéines à domaine PAC a pu être associée à la terrestrialisation. Une analyse phylogénique a permis de grouper les domaines PAC en 10 clades, chacun comportant un domaine PAC d'Amborella trichopoda. Outre les 6 résidus Cys caractérisant le domaine PAC, des motifs conservés ont été repérés dans les clades, ouvrant la voie pour des études fonctionnelles. Des tests in vitro ont montré que les domaines PAC interagissent avec différents types de polysaccharides pariétaux et permis de définir trois types de spécificité vis-à-vis de polysaccharides tels que les ß(1,4) galactanes/RGI, les mannanes, les xyloglucanes et/ou la cellulose. Un nouveau modèle d'interactions supramoléculaires dans les parois végétales faisant intervenir des protéines à domaine PAC et des polysaccharides pariétaux a été proposéThe plant primary cell wall is a dynamic envelope involved in development and in response to environmental constraints. It is composed of networks of polysaccharides and proteins to which multi-domain proteins like LRX (Leucine-Rich repeat Extensin) and PAC (Proline-rich Arabinogalactan Protein Cys-containing) domain proteins contribute. This work aimed at finding partners of such proteins in cell walls using different experimental approaches. Proteomics analyses have been performed on proteins extracted from cell walls of roots of wild type or lrx1 plants. They have allowed the identification of 424/434 cell wall proteins of wild type/lrx1 roots respectively as well as of 25 candidate proteins which could play a role in root hair morphogenesis. Besides, PAC domain proteins have been identified in all the studied terrestrial plants using a bioinformatic approach. The appearance of PAC domain proteins could be associated to terrestrialisation. A phylogenic analysis has allowed to group PAC domains in 10 clades, each of them containing a PAC domain of Amborella trichopoda, an ancestor of angiosperms. In addition to the 6 Cys residues which define the PAC domain, conserved motifs have been identified in each clade. This finding opens the way to functional studies. In vitro tests have shown that the PAC domains could interact with different kinds of cell wall polysaccharides. Three types of specificity could be defined towards ß(1,4) galactans/RGI, mannans, xyloglucans and/or cellulose. A new model of molecular interactions in plant cell walls including PAC domain proteins and polysaccharides has been propose