Targeted Limb Heating Augments the Actions of IGF1 in the Growth Plate and Increases Bone Elongation in Growing Mice

Bone elongation disorders can lead to painful musculoskeletal disabilities in adulthood. Existing treatment options to correct left-right asymmetry in limb length include invasive surgeries and/or drug regimens. These are often only partially effective. Previous studies in weanling mice have shown that a daily application of mild heat (40°C) to limbs on one side of the body could be used to noninvasively enhance bone elongation. However, the impact of heat-treatment on bone at the cellular level remains elusive. The epiphyseal growth plate, the band of cartilage located at each end of long bones, is the main site of longitudinal growth and is regulated by local and systemic growth factors. Insulin-like growth factor 1 (IGF1) is the major regulator of growth and controls bone elongation by promoting chondrocyte proliferation and hypertrophy. The objective of this study was to build upon an established method of targeted limb heating to determine how heat-treatment influences IGF1 action in the growth plate. This study tests the hypothesis that exposure to warm temperature augments the actions of IGF1 in the growth plate and permanently increases length of the extremities. This dissertation demonstrates that differences of less than 1.5% are functionally significant measured by a nearly 20% increase in hindlimb weight bearing on heat-treated sides. Heat-enhanced bone elongation is documented in female C57BL/6 mice after 7 days of heat-treatment during the most active period of growth from 3-4 weeks of age. This increase in bone elongation is accompanied by increased chondrocyte proliferation and hypertrophy in the proximal tibial growth plate. Moreover, this study is the first to show that targeted limb-heating impacts local action of IGF1 in growth plate chondrocytes. Results suggest that heat-induced limb length is IGF1 dependent since the growth effects are attenuated when IGF1 activity is blocked. Administration of a low dose of IGF1 (2.5mg/kg) was found to augment heat enhanced bone elongation and effects were sustained to skeletal maturity (12 weeks of age). These studies help contribute to the ultimate goal of developing a noninvasive method for lengthening bones that may translate in a clinical setting to treat linear growth disorders in children

The ever-expanding conundrum of primary osteoporosis: aetiopathogenesis, diagnosis, and treatment.

In recent years, as knowledge regarding the etiopathogenetic mechanisms of bone involvement characterizing many diseases has increased and diagnostic techniques evaluating bone health have progressively improved, the problem of low bone mass/quality in children and adolescents has attracted more and more attention, and the body evidence that there are groups of children who may be at risk of osteoporosis has grown. This interest is linked to an increased understanding that a higher peak bone mass (PBM) may be one of the most important determinants affecting the age of onset of osteoporosis in adulthood. This review provides an updated picture of bone pathophysiology and characteristics in children and adolescents with paediatric osteoporosis, taking into account the major causes of primary osteoporosis (PO) and evaluating the major aspects of bone densitometry in these patients. Finally, some options for the treatment of PO will be briefly discussed

Effects of dance therapy on balance, gait and neuro-psychological performances in patients with Parkinson's disease and postural instability

Postural Instability (PI) is a core feature of Parkinson’s Disease (PD) and a major cause of falls and disabilities. Impairment of executive functions has been called as an aggravating factor on motor performances. Dance therapy has been shown effective for improving gait and has been suggested as an alternative rehabilitative method. To evaluate gait performance, spatial-temporal (S-T) gait parameters and cognitive performances in a cohort of patients with PD and PI modifications in balance after a cycle of dance therapy

Étude des déterminants génétiques et moléculaires de la scoliose idiopathique

La scoliose idiopathique (SI) est une maladie complexe de la colonne vertébrale. Elle survient principalement à l'adolescence et affecte ~ 1-4% de la population mondiale pédiatrique avec une prévalence plus élevée chez les femmes. Dans la plupart des cas, la cause sous-jacente de la SI est inconnue, bien qu'une composante génétique soit bien reconnue. Un certain nombre de gènes et de loci candidats ont été proposés, mais peu ont été répliqués avec succès dans de multiples études. Les études d'association génomique (GWAS) ont identifié plusieurs gènes candidats prédisposant à la SI. Parmi ceux-ci, le locus LBX1 est de loin celui qui a été répliqué avec le plus de succès dans différentes populations, bien que jusqu'à maintenant il n'ait pas été testé dans la population québécoise. L’objectif principal de cette thèse, a été l'étude des déterminants génétiques de la SI par des approches complémentaires. Dans la première étude, de nouveaux gènes enrichis de variants rares, pouvant contribuer à la maladie ont été identifiés par séquençage d’exomes entiers (WES) dans une cohorte de patients québécois atteints de SI, suivi d'une deuxième phase de séquençage ciblé des 24 meilleurs gènes candidats dans une seconde cohorte indépendante. Parallèlement, nous avons effectué une approche par WES dans une famille multiplex unique constituée de trois soeurs affectées avec des parents sains. Nos résultats impliquent un nouveau gène, FAT3, non précédemment associé à la SI, comme un gène candidat d’importance pour cette condition. Dans la deuxième étude, nous avons effectué un GWAS pour tester les marqueurs génétiques associés à la dans la population québécoise. Les résultats complets de l'analyse GWAS dépassent le cadre de cette thèse. L'objectif principal de l'analyse actuelle était de tester l'association du locus LBX1. Nos résultats appuient une association avec la région proche du gène LBX1 dans notre population. Dans la troisième étude, notre approche est une approche de gène candidat. Nous avons essayé d'élucider les corrélations génétiques et biochimiques des niveaux circulants en YKL-40 avec le risque de progression de la maladie. Une étude antérieure dans notre laboratoire a démontré que les patients atteints de SI ont un dysfonctionnement distinctif de la signalisation des récepteurs couplés aux protéines Gi inhibitrices (Gi), permettant leur classification en trois endophénotypes (FG1, FG2 et FG3). L'étude des profils d'expression de ces endophénotypes a montré une élévation significative de l'expression du gène CHI3L1, codant pour la glycoprotéine sécrétée YKL-40, chez les patients classés dans l’endophénotype FG1 par rapport à ceux classés dans les endophénotypes FG2 et FG3 qui sont plus enclins à développer une scoliose sévère. Nous avons démontré que les garçons du groupe FG1 présentent des niveaux plasmatiques significativement plus élevés en YKL-40 que les autres groupes tout comme les patients présentant une scoliose non-sévère. Les SNP dans le gène CH13L1 ont montré une association significative avec les niveaux plasmatiques d’YKL-40 dans des cas non-sévère. L'analyse fonctionnelle in vitro a révélé que la glycoprotéine YKL-40 pourrait jouer un rôle protecteur dans le contexte de la SI en bloquant le défaut de signalisation Gi induit par l'élévation de l'ostéopontine. En résumé, nous proposons une nouvelle association du gène FAT3 avec la SI, répliquons l'association du gène LBX1 dans une nouvelle cohorte et proposons un nouveau marqueur biochimique, YKL-40, associé à des formes non sévères de la SI.Idiopathic Scoliosis (IS) is a complex disorder of the spine. It mostly occurs between 10 and 15 years old and affects ~1-4% of the global pediatric population with a much higher prevalence in females. In most cases the underlying cause of IS is unknown, although a genetic component is well recognized. A number of candidate genes and loci have been suggested, but few have been successfully replicated in multiple studies. Genome wide association studies (GWAS) have identified several candidate genes for IS susceptibility. Among these the LBX1 locus is by far the most successfully replicated locus in different populations, although until now it has not been tested in the French-Canadian population. Few studies have attempted to detect rare causal variants in IS and this field of research is still in its infancy. The primary goal of this thesis was to investigate the genetic component of IS through complementary approaches. In the first study, we aimed to find new genes enriched with rare variants, which might contribute to the disease. Hence, we performed whole exome sequencing (WES) in a French-Canadian IS cohort, followed by a second phase of targeted sequencing of the 24 best candidate genes in a replication cohort. In parallel, we performed WES in a unique multiplex family of three affected sisters with healthy parents. Our results implicate a novel gene, FAT3, not previously associated with IS, as a strong candidate for this condition. In the second study we performed a GWAS to test for genetic markers associated with IS in our French-Canadian cohort. The complete results of the GWAS analysis are beyond the scope of this thesis. The main objective of the current analysis was to test association of the LBX1 locus. Our results support an association with the region near the LBX1 gene in our French-Canadian population. In the third study, our approach is a candidate gene approach. We attempted to elucidate the genetic and biochemical correlates of circulating YKL-40 levels with the risk of spinal deformity progression in the context of IS. Our prior works have demonstrated that IS patients exhibit a distinctive G inhibitory (Gi) proteincoupled receptor signaling dysfunction, which enabled their classification into three distinct biological endophenotypes (FG1, FG2 or FG3). Previous microarray analysis revealed a significant elevation in the expression of CHI3L1 gene, encoding for the secreted glycoprotein YKL-40, in IS patients classified in FG1 endophenotype when compared to FG2 and FG3 ones, which are more prone to develop a severe scoliosis. In this study, we demonstrated that IS males classified in FG1 endophenotype exhibit significant higher plasma YKL-40 levels than controls and other IS endophenotypes. Furthermore, the non-severe scoliosis group showed significant higher levels of YKL-40 than controls. SNPs in CHI3L1 gene showed significant association with YKL-40 plasma levels in non-severe cases. Functional in vitro analysis showed that YKL-40 could play a protective role in the context of IS by altering the Gi-signaling dysfunction induced by the elevation of osteopontin in IS. In sum, we propose a novel association of FAT3 gene with IS, replicated the association of LBX1 gene with IS in a new cohort, and propose a new biochemical marker, YKL-40, associated with non-severe forms of IS and has a plausible protective role in IS

Effets de l'estradiol et du chargement mécanique sur la régulation de la POC5 et du récepteur ADGRG7 dans la scoliose idiopathique

La scoliose est une déformation complexe en 3D de la colonne vertébrale ayant une prévalence de 1.5-3% dans la population générale. La forme la plus commune est la scoliose idiopathique (SI) qui inclue la scoliose idiopathique de l’adolescent (SIA) affectant principalement les filles au cours de la puberté. L’étiologie est largement inconnue, mais les observations cliniques révèlent un rôle de l’hérédité ainsi que d’une croissance rapide dans le développement de la SIA. Il existe une forte évidence qu’une composante génétique entre en jeu dans cette pathologie. Récemment, de nombreux gènes ont été suspectés d’être responsables ou de contribuer à la SI. Notre équipe a identifié des variantes du gène POC5, codant pour une protéine centriolaire, dans une large famille française dont plusieurs membres sont atteints de SI. Dans cette même famille, nous avons suspecté l’implication d’une mutation du gène ADGRG7 (récepteur orphelin appartenant aux récepteurs d’adhésion couplés aux protéines G) dans la pathogénicité de la SI. Au travers de nos travaux, nous nous sommes concentrés sur l’élucidation du rôle des protéines POC5 sauvages et mutantes (in vitro et in vivo) ainsi que sur la régulation de l’expression de POC5 et ADGRG7 par l’estradiol (E2), dans le but de tester si ces gènes pourraient être fonctionnellement liés à la scoliose. Afin d’investiguer le rôle du gène POC5 dans la SI, nous avons surexprimé la protéine POC5 mutante dans des lignées cellulaires par transfection transitoire (in vitro) et nous avons induit une perte de fonction du gène POC5 dans un modèle animal, le poisson zèbre (in vivo). Le rôle de POC5 a été étudié par : 1) Analyses de spectroscopie de masse et co-immunoprécipitation afin d’identifier les différents partenaires de liaisons entre la protéine sauvage (wt POC5) et mutante (mut POC5); 2) immunolocalisation de la protéine sauvage et mutante au niveau cellulaire; 3) histologie et immunohistochimie réalisés sur des tissus issus de poissons zèbres contrôles (wt POC5) et scoliotiques (mut POC5). Notre travail a permis d’identifier plusieurs protéines partenaires de la POC5, et nous avons trouvé des interactions fonctionnelles entre ces protéines et la POC5 reliées aux cils et centrosome. Un certain nombre de protéines ciliaires ont été identifiées comme interagissant avec wt POC5 et non avec mut POC5 comme CEP290, RAB11, CKAP5, Annexine 2 et Septine 9. Au niveau cellulaire, la localisation et la colocalisation des protéines wt POC5 et POC5 mutée avec la tubuline alpha acétylée (marqueur ciliaire), confirme la conséquence de la mutation sur la localisation subcellulaire en relation avec la longueur et l’intensité de la coloration du cil. In vivo, nous avons identifié de nombreux défauts de la rétine et de l’oreille interne chez le poisson zèbre POC5 mutant par rapport au contrôle. Enfin, en utilisant différents marqueurs des couches rétiniennes et la tubuline acétylée, nous avons localisé ces défauts dans le segment externe et les cônes de la rétine. Afin d’étudier le rôle possible de POC5 et ADGRG7 dans la SI, nous avons examiné comment POC5 et ADGRG7 est régulé au niveau transcriptionnel. Nous avons utilisé des modèles cellulaires, des ostéoblastes humains dérivées de contrôles et de SIA patient, et nous avons étudié l’expression de la protéine POC5 et ADGRG7 en réponse à une stimulation par l’E2. La région promotrice du gène ADGRG7 a été clonée et analysée pour les éléments cis médiant les effets de l’E2. Les analyses de délétion du promoteur indiquent que le site SP1 dans le fragment 474bp est requis pour une activité basale ainsi que pour une activation hormone-dépendante, et des mutations dans les sites de liaison au sein de cette région résultent en la perte de transactivation. Les résultats d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) ont montré que le site SP1 ESRα lie le promoteur d’ADGRG7. Nos résultats suggèrent que la régulation de l’expression d’ADGRG7 par l’E2 est due à l’association des protéines ESRα et SP1 au promoteur d’ADGRG7. La même stratégie expérimentale a été appliquée pour l'étude de la régulation de POC5 par E2. L'analyse de délétion et ChIP ont confirmé la régulation de POC5 à travers ESRα. Basé sur des études de promoteur, qPCR, Western blot et ChIP, cette étude clarifie comment POC5 et ADGRG7 sont régulées par l’E2. Un autre aspect de ce projet était d’étudier les différents effets du chargement mécanique sur des cellules, incluant des ostéoblastes humains, exprimant POC5 sauvage ou mutée. Les cellules ont été soumises à un stress mécanique à différents temps, et différentes voies de signalisations (incluant ERK, p38, NFκB) ont été testées. Nos résultats montrent une différence dans la réponse des cellules surexprimant POC5 mutée par rapport aux cellules contrôles. Les effets du chargement comprenant les différentes voies de signalisations ont été montrés comme étant initiés via TRPV4, un canal calcique perméable activé par l’étirement localisé dans le cil primaire et la membrane plasmique.Scoliosis is a complex three-dimensional deformity of the spine, with 1.5–3% prevalence in the general population. The most commonly known type of scoliosis is idiopathic scoliosis (IS), including adolescent idiopathic scoliosis (AIS) affecting principally girls during puberty. The etiology is largely unknown, but clinical observations revealed the role of hereditary and rapid growth in the development of this condition. There exists strong evidence that there is a genetic component to the disease. More recently, several genes were suspected to cause or contribute to IS. Our group identified gene variants of POC5 centriolar protein in a large French family with multiple members affected with IS. In the same family, we suspected the involvement of ADGRG7 (an orphan receptor that belongs to the Adhesion G protein-coupled receptors) gene mutation in the pathogenicity of IS. In the present work, we focused on elucidating the role of wild type (wt) and mutant (mut) POC5 proteins (in vitro and in vivo) as well as the regulation of POC5 and ADGRG7 by estradiol (E2), with the goal to test whether these genes could be functionally connected with scoliosis. To investigate the role of POC5 gene in IS, we overexpressed mutant POC5 in cell lines by transient transfection (in vitro study) and created a loss-of-function model in zebrafish (in vivo study). The role of POC5 was investigated by: 1) mass spectroscopy analysis and co-immunoprecipitation to identify differences in binding partners between the wt POC5 and mut POC5 proteins; 2) immunolocalization of wt and mut POC5 proteins at the cellular level; 3) histology and immunohistochemistry performed on tissues from wt (control) and scoliotic (poc5 mut) zebrafish. Our work identified several interacting partners with POC5, and documented functional connections with respect to cilia and centrosome dysfunction. A number of ciliary proteins were identified to be interacting with wt POC5 but not mut POC5 like CEP290, RAB11, CKAP5, Annexin 2 and Septin 9. At the cellular level, localization and co-localisation of wt POC5 and mut POC5 protein with alpha acetylated tubulin (cilia marker), confirmed the consequence of the mutation on subcellular location with respect to cilium length and staining intensity. In vivo, several defects in the retina of zebrafish and inner ear were identified in mutpoc5 zebrafish compared to wt zebrafish. Finally, using different markers for retinal layers and alpha acetylated tubulin, the defects were localized in the outer segment layer and cones of the retina. To further investigate the possible roles of POC5 and ADGRG7 in IS, we examined how POC5 and ADGRG7 are regulated at the transcriptional level. Human osteoblasts derived from control and AIS patients were used as a cell model, and the expression of POC5 and ADGRG7 protein was monitored upon E2 stimulation. The promoter region of the human POC5 and ADGRG7 gene was then cloned and analyzed for functional cis-elements mediating effects of E2. Deletion analysis of the ADGRG7 promoter indicates that the SP1 site in the 474bp fragment is required for both basal activity and hormone-induced activation, and mutations of the binding sites within this region result in the loss of transactivation. Further results from chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay showed that SP1 and ESRα bind to ADGRG7 promoter. Our results suggest that the regulation of ADGRG7 expression by E2 is due to the association of ESRα and SP1 proteins to ADGRG7 promoter. The same experimental strategy was applied for studying the POC5 regulation by E2. Deletion analysis and ChIP confirmed the regulation of POC5 through ESRα. Through promoter studies, qPCR, and western blot and (ChIP) assay, this study clarifies how POC5 and ADGRG7 are regulated by E2. Another aspect of this project was to study the differential effects of mechanical stress on wt and mut POC5 expressing cells, including human osteoblasts. Cells were exposed to mechanical stress for different time points and then different signalling pathways (including ERK, p38, NFκB) were tested. Our results show that there is difference in the response of control normal cells and cells overexpressing the mut POC5. The effects of loading including the signalling pathways were found to be initiated through TRPV4 which is a stretch-activated Ca2+- permeable channel and localizes to the primary cilium and plasma membrane. The importance of this work is that it covers several factors that contribute to the pathogenesis of AIS. Based on our findings, AIS is a complex multifactorial disease where POC5, cilia, E2 and mechanical load intreplay in the pathogenesis of the disease. The significance of this work is that it puts the basics for understanding the molecular mechanisms that are implicated in AIS